La fluorescencia es un tipo de luminiscencia causada por fotones que excitan una molécula, llevándola a un estado electrónico excitado. Se produce por la absorción de fotones en el estado fundamental singlete, promovido a un estado singlete-excitado. Cuando la molécula excitada vuelve al estado fundamental, emite un fotón de menor energía, que corresponde a una longitud de onda más larga, que el fotón absorbido.
La espectroscopía de fluorescencia analiza la fluorescencia de una molécula basándose en sus propiedades fluorescentes. La fluorescencia es un tipo de luminiscencia causada por fotones que excitan una molécula, llevándola a un estado electrónico excitado.
Fig. 3: El diagrama de Jablonski de la absorbancia molecular y la fluorescencia
La Fig. 3 muestra el diagrama de Jablonski (Jablonski, 1933), un esquema de la transición del estado electrónico de una molécula durante el fenómeno de fluorescencia. El eje izquierdo muestra una energía creciente, mientras que una molécula fluorescente típica tiene un espectro de absorbancia. Este espectro muestra la energía o longitudes de onda donde la molécula absorberá la luz.
Desintegración de fluorescencia durante la vida útil de la fluoresceína (rojo), respuesta del instrumento (azul) y ajuste (verde).
En términos sencillos, la vida útil de fluorescencia de una molécula es el tiempo medio que pasa en el estado excitado. Esto depende del tipo de molécula y de su entorno local. Normalmente, el estado excitado decae de manera exponencial, como se indica en la ecuación siguiente. El uso de la vida útil de fluorescencia tiene sus ventajas frente a una medición de intensidad, ya que es una medición "absoluta", en lugar de la medición "relativa" en estado estacionario (que proporciona una señal promediada en el tiempo).
I(t) = I 0 exp (-t/τ)
τ es la vida útil de la fluorescencia o el tiempo para que la intensidad decaiga a 1/e de su valor inicial.
Si hay más de un estado excitado, a veces porque la muestra en estudio contiene una mezcla de moléculas fluorescentes y existen diferentes entornos locales o una molécula sufre una transformación, dando lugar a diferentes especies en estado excitado, se espera que la desintegración sea más compleja. Puede haber una desintegración exponencial por cada estado excitado presente. Esto puede representarse mediante una suma de exponenciales (véase más abajo), donde α (el factor preexponencial) indica la concentración relativa de cada decaimiento t respecto a la desintegración general observada.
Ecuaciones para obtener vidas útiles de fluorescencia, constantes en tiempo de componente, amplitudes y promedios
Para comparar mediciones, a menudo es útil normalizar los factores preexponenciales de alguna manera. Si se requiere una comparación de la concentración de cada especie fluorescente, entonces se puede utilizar la α normalizada. Si se necesita una comparación de la contribución al espectro de estado estacionario (emisión total de fluorescencia), entonces se puede utilizar la amplitud fraccionaria o relativa (en %) (en %). Este último es el factor preexponencial ponderado por la vida útil.
A veces, puede ser igual de aceptable representar una decadencia compleja a lo largo de una vida media. Sin embargo, debe señalarse que esto se hace mejor modelando correctamente la desintegración compleja, en lugar de intentar simplemente ajustar una única desintegración exponencial. En la mayoría de los casos, el uso de la vida útil media de amplitud es apropiado, sin embargo, al considerar experimentos de temple, es más correcto emplear la duración media de la fluorescencia de intensidad. Existen obras publicadas que detallan los méritos relativos de estos promedios. (Lakowicz, 2006) (Berezin, 2010)
Las mediciones de fosforescencia utilizan una fuente pulsada de mayor duración, como una lámpara de flash de xenón.
La fosforescencia es un proceso en el que el fotón se emite, no desde un estado excitado por singlete, sino desde un estado triplete prohibido. La escala temporal de emisión suele estar en el rango de picosegundos a nanosegundos, mientras que la fosforescencia suele durar microsegundos, milisegundos o incluso más tiempo... minutos u horas. Los investigadores suelen utilizar una fuente pulsada, como una lámpara de flash o un LED, para medir espectros de fosforescencia y decaimientos en estas escalas de tiempo más largas. Las mediciones de fosforescencia utilizan una fuente pulsada de mayor duración, como una lámpara de flash de xenón. El tiempo de la lámpara intermitente puede utilizarse para medir espectros a diferentes vidas de fosforescencia.
Las mediciones de fosforescencia utilizan una fuente pulsada de mayor duración, como una lámpara de flash de xenón. El tiempo de la lámpara intermitente puede utilizarse para medir espectros a diferentes vidas de fosforescencia.
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