Como ejemplo de un experimento de fluorescencia de punto único, aquí hay una curva de calibración de un conjunto conocido de microesferas fluorescentes.
Dado que la intensidad de fluorescencia depende de la concentración de la molécula fluorescente, se pueden generar fácilmente curvas de concentración estándar que se utilizan para determinar concentraciones de la misma molécula en muestras desconocidas.
Esto es útil en experimentos de temple, donde los aditivos disminuyen la intensidad de los fluoróforos de forma sistemática. También se pueden crear curvas de concentración para estudiar cómo otras moléculas interactúan con cosas como proteínas, y pueden usarse para seguir sistemáticamente los cambios estructurales, plegamientos, despliegues, asociación y disociación de proteínas.
Como ejemplo de un experimento de fluorescencia de punto único, aquí hay una curva de calibración de un conjunto conocido de microesferas fluorescentes. Se utilizaron cinco soluciones de concentración conocidas para crear la curva estándar. La curva se ajustó a un polinomio lineal y el ajuste se utilizó para calcular la concentración de perlas en una solución desconocida.
Espectros de naftaleno disueltos en metanol medidos a temperatura ambiente (298K) y en un accesorio dewar de nitrógeno líquido (77K) en un HORIBA Fluorolog-3.
La temperatura sí influye en la intensidad de la fluorescencia y, a veces, también en la longitud de onda espectral y la forma. El coeficiente de extinción molar de un emisor de fluorescencia (o constante de tasa radiativa) suele depender débilmente de la temperatura. Sin embargo, la constante de velocidad no radiativa, que está regida por el acoplamiento vibracional, se ve fuertemente afectada y aumentará con el aumento de la temperatura. Esto significa que la fluorescencia disminuirá con el aumento de la temperatura, en general. De manera similar, el temple colisional también aumenta con la temperatura, disminuyendo también la intensidad de fluorescencia.
La fluorescencia está muy influenciada por las moléculas alrededor de la molécula emisora. Además, los fluoróforos medidos a temperaturas muy bajas utilizando nitrógeno líquido o helio líquido muestran una fluorescencia aumentada y también mayores cantidades de estructura vibracional en los espectros de excitación y emisión. El apagado colisional disminuye y la constante de tasa no radiativa también disminuye, aumentando la intensidad de emisión de fluorescencia.
Moléculas como los hidrocarburos poliaromáticos (es decir, antraceno, naftaleno, pireno, perileno, etc.) tienen picos vibracionales que aparecen en el espectro a temperatura ambiente. A una temperatura de nitrógeno líquido de 77 K, estos picos de fluorescencia se vuelven más estructurados y los picos de fosforescencia se vuelven medibles. Estos se midieron tanto a 298 K como a 77 K en un accesorio de muestreo Dewar de nitrógeno líquido.
Espectro de emisión en blanco (rojo) de microesferas rojas a 6,7x104 perlas/mL (lexc=542 nm).
Los picos Raman suelen aparecer en un espectro de fluorescencia, especialmente si la intensidad de fluorescencia es débil. Para eliminar un pico Raman, el espectro de un disolvente en blanco puede medirse bajo las mismas condiciones que el de la muestra y este espectro "en blanco" se resta del espectro de muestra fluorescente. Como un pico Raman es un fenómeno vibracional relacionado con la energía de la luz de excitación, la posición puede controlarse en cierta medida. Un pico Raman se acercará o alejará de la longitud de onda de excitación si la excitación se mueve más hacia el azul o hacia el rojo, respectivamente. Así, si un pico Raman interfiere con el espectro de fluorescencia de una muestra, la longitud de onda de excitación puede moverse para situar el pico Raman en una ubicación ligeramente diferente si es necesario.
Cambios espectrales como resultado del despliegue térmico de la albúmina sérica bovina (BSA) usando un fluorómetro QuantaMaster
Los espectros de fluorescencia también pueden utilizarse para seguir cambios en el plegamiento o despliegue de proteínas. Este es un ejemplo de cómo se ve el espectro de fluorescencia del triptófano en una solución de 1 μM BSA con el aumento de la temperatura. Estas curvas representan la temperatura que va de 5 a 70 °C. Se puede ver cómo la intensidad disminuye, así como el espectro desplazarse a longitudes de onda más cortas a medida que aumenta la temperatura. La anisotropía o anisotropía resolta en el tiempo también podría utilizarse para obtener información sobre el tamaño, la forma y el movimiento de orientación de la proteína.
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