¿Qué es una medición de fluorescencia?

La mayoría de las moléculas ocupan el estado de energía más bajo a temperatura ambiente, conocido como estado fundamental. Dentro de este estado fundamental existen niveles vibracionales. Antes de excitarse, muchas moléculas ocupan el nivel vibracional más bajo.

El fotón absorbido hace que la molécula adopte un estado de energía vibracional más alto cuando una molécula absorbe una determinada longitud de onda de luz. Las moléculas colisionan entonces con otras, haciendo que pierdan su energía vibracional y regresen al nivel vibracional más bajo del estado excitado. La molécula puede entonces volver a los niveles vibracionales del estado fundamental.

Cuando la molécula vuelve al estado fundamental, emite un fotón de luz a una longitud de onda diferente a la que la excitó. Es cuando la molécula muestra fluorescencia. (Véase diagrama de Jablonski)

La fluorescencia se puede medir mediante fluorómetros. Un fluorómetro es un instrumento diseñado para medir los distintos parámetros de fluorescencia, incluyendo su intensidad y distribución de longitud de onda de la emisión tras la excitación. Los químicos utilizan esto para identificar propiedades y la cantidad de moléculas específicas en una muestra.

Los químicos llaman fluoróforos a moléculas que pueden exhibir fluoróforos.

Los científicos utilizan espectrómetros de fluorescencia para excitar moléculas de fluoróforo y medir su fluorescencia emitida. El espectrómetro introduce luz ultravioleta o visible mediante una fuente de fotones, como un láser, una lámpara de xenón o LEDs. La luz pasa a través de un monocromador que selecciona una longitud de onda específica, a menudo utilizando una red de difracción. Una rejilla de difracción es una placa de vidrio o metal con líneas paralelas muy cercanas, que produce un espectro por difracción e interferencia de la luz. La luz que sale sale en un ángulo específico dependiendo de su longitud de onda.

El espectrómetro enfoca la longitud de onda monocromática hacia la muestra. La muestra emite una longitud de onda, que viaja hasta el detector. El detector suele estar ajustado en un ángulo de 90 grados respecto a la fuente de luz para evitar cualquier interferencia de la luz de excitación transmitida.

Los fotones emitidos impactan en un fotodetector. El software informático conectado al detector genera un espectro, una representación gráfica que muestra qué longitudes de onda absorbe la muestra.

El espectro de emisión muestra qué longitudes de onda emiten las muestras.