La espectroscopía de fluorescencia es un método de investigación basado en las propiedades de fluorescencia de la muestra en estudio, y se utiliza para mediciones cuantitativas de productos químicos.
La espectroscopía de fluorescencia analiza la fluorescencia de una molécula basándose en sus propiedades fluorescentes.
La fluorescencia es un tipo de luminiscencia causada por fotones que excitan una molécula, llevándola a un estado electrónico excitado.
La espectroscopía de fluorescencia utiliza un haz de luz que excita los electrones en las moléculas de ciertos compuestos y hace que emitan luz. Esa luz se dirige hacia un filtro y hacia un detector para medir e identificar la molécula o los cambios en ella.
>> Explora nuestras soluciones de espectroscopía de fluorescencia <<
El término fluorescencia se refiere a un tipo de luminiscencia. La luminiscencia, en términos generales, es la emisión de luz de una molécula. Existen varios tipos de luminiscencia.
La fotoluminiscencia es cuando la energía lumínica, o fotones, estimula la emisión de un fotón.
La quimioluminiscencia se define cuando la energía química estimula la emisión de un fotón, e incluye la bioluminiscencia, como se observa en luciérnagas y muchas formas de vida marina.
La electroluminiscencia es cuando la energía eléctrica o un campo eléctrico fuerte estimula la emisión de un fotón, como ocurre en algunas aplicaciones de iluminación.
La fluorescencia, específicamente, es un tipo de fotoluminiscencia en la que la luz eleva un electrón a un estado excitado. El estado excitado sufre una rápida pérdida de energía térmica al entorno a través de vibraciones, y luego se emite un fotón desde el estado excitado singlete más bajo. Este proceso de emisión de fotones compite con otros procesos no radiativos, incluyendo la transferencia de energía y la pérdida de calor.
Cuando se utiliza el término "fluorescencia", normalmente se pueden aplicar los mismos métodos de medición a cualquiera de las categorías de luminiscencia anteriores.
Los espectros de emisión y excitación de un fluoróforo dado son imágenes especulares entre sí
Los espectros de fluorescencia en estado estacionario son cuando moléculas, excitadas por una fuente constante de luz, emiten fluorescencia, y los fotones emitidos, o intensidad, se detectan en función de la longitud de onda. Un espectro de emisión de fluorescencia es cuando la longitud de onda de excitación está fija y se escanea la longitud de onda de emisión para obtener un gráfico de intensidad frente a longitud de onda de emisión.
Un espectro de excitación de fluorescencia es cuando la longitud de onda de emisión está fija y se escanea la longitud de onda del monocromador de excitación. De este modo, el espectro proporciona información sobre las longitudes de onda a las que una muestra absorberá para emitir en la única longitud de onda de emisión elegida para la observación. Es análoga al espectro de absorbencia, pero es una técnica mucho más sensible en cuanto a límites de detección y especificidad molecular. Los espectros de excitación son específicos de una sola longitud de onda/especie emisora, a diferencia de un espectro de absorbencia, que mide todas las especies absorbentes en una solución o muestra. Los espectros de emisión y excitación de un fluoróforo dado son imágenes especulares entre sí. Normalmente, el espectro de emisión ocurre en longitudes de onda más altas (energía más baja) que el espectro de excitación o absorbancia.
Estos dos tipos espectrales (emisión y excitación) se utilizan para observar cómo cambia una muestra. La intensidad espectral y/o la longitud de onda máxima pueden variar con variantes como la temperatura, la concentración o las interacciones con otras moléculas que la rodean. Esto incluye moléculas de apagamiento y moléculas o materiales que implican transferencia de energía. Algunos fluoróforos también son sensibles a propiedades del entorno del disolvente como el pH, la polaridad y ciertas concentraciones de iones.
>> Explora nuestras soluciones de espectroscopía de fluorescencia <<
Espectros de emisión de fluorescencia de algunos fluoróforos comunes a lo largo de los espectros UV y visible.
Las moléculas y materiales fluorescentes vienen en todas las formas y tamaños. Algunos son intrínsecamente fluorescentes, como la clorofila y los residuos de aminoácidos triptófano (Trp), fenilalanina (Phe) y tirosina (Tyr). Otras son moléculas sintetizadas específicamente como tintes orgánicos estables o etiquetas para añadirse a sistemas que de otro modo serían no fluorescentes. Existen catálogos completos de estos disponibles. Normalmente, las moléculas fluorescentes orgánicas tienen anillos aromáticos y electrones conjugados en pi. Dependiendo de su tamaño y estructura, los tintes orgánicos pueden emitirse desde la luz UV hacia el infrarrojo cercano.
Aquí tienes una muestra aleatoria de algunos fluoróforos comunes que abarcan los rangos UV y visible. Algunos elementos de tierras raras, o lantánidos, tienen orbitales electrónicos más altos llenos, donde los electrones transitan debido a transferencias de carga de ligando metálico entre orbitales 4f-5d e incluso 4f-4f. (Bunzli, 1989) Hay muchas moléculas que son luminiscentes por naturaleza, como algunos aminoácidos, clorofilas y pigmentos naturales. Otros están altamente diseñados para usos muy específicos de espectroscopía de fluorescencia.
Algunas de las categorías de moléculas y materiales fluorescentes son:
Otras moléculas y materiales como proteínas fluorescentes, semiconductores, fósforos y elementos de tierras raras se encuentran entre las muestras fluorescentes más usadas. Los polímeros con aromáticos conjugados o dienes también suelen tener propiedades fluorescentes. Por supuesto, se crean nuevos materiales todo el tiempo.
Para el libro más completo sobre espectroscopía de fluorescencia, por favor lea el libro del Dr. Joseph Lakowicz, Principios de la espectroscopía de fluorescencia, tercera edición.
Tiene alguna pregunta o solicitud? Utilice este formulario para ponerse en contacto con nuestros especialistas.
