¿Qué es la fluorescencia ratiométrica?

La fluorescencia ratiométrica es el método en el que se miden intensidades en dos o más longitudes de onda de un espectro de excitación o emisión para detectar cambios en el entorno local. Normalmente, se utiliza una sonda que es específicamente sensible a un parámetro ambiental como la concentración de iones, el pH, la viscosidad o la polaridad.

La aplicación de colorantes ratiométricos para encontrar propiedades sensibles a las sondas, como la concentración de iones, puede emplearse midiendo espectros o cinética.

En el espectro de Fura-2, se puede ver que la excitación de fluorescencia tiene dos picos que reflejan directamente la unión del calcio iónico libre en solución. A altas concentraciones de calcio iónico libre, el pico de excitación en 340 nm es comparativamente alto. Cuando la concentración de calcio iónico libre es baja, el pico de excitación a 380 nm aumenta en relación con el pico de 340 nm.

Tomar la relación de las intensidades en dos longitudes de onda de excitación desde estos picos se correlaciona directamente con la concentración intracelular de calcio iónico libre. Medir la proporción de fluorescencia a 510 nm cuando se excita a 340 nm y a 380 nm a lo largo del tiempo dará un gráfico basado en el tiempo de cómo una solución cambia en la concentración de cationes de calcio. La absorción celular de calcio iónico libre se mide de esta manera.

Existen otras sondas que tienen espectros de fluorescencia que varían de la misma manera en propiedades físicas como la polaridad del disolvente, el pH y las concentraciones de otros iones como sodio, potasio y magnesio.

Aquí hay un gráfico de la razón, que indica la respuesta intracelular de calcio de una célula aurícula cargada con Fura-2. Tomando la relación entre ambas intensidades a lo largo del tiempo, la concentración de iones de calcio puede correlacionarse directamente con esta curva cinética.