Nuestros sistemas se basan en SPR acoplado por prisma en la configuración Kretschmann.
Nuestros sistemas se basan en SPR acoplado por prisma en la configuración Kretschmann.
Un haz colimado se envía hacia la superficie dorada funcionalizada a través del prisma para iluminar toda la matriz manchada. No es necesario realizar un escaneo 2D de la matriz.
Tras la reflexión en el chip, el haz es interceptado por el sensor de imagen de la cámara (matriz 2D), donde cada píxel corresponde a una ubicación dada en el SPRi-Biochip.
La configuración óptica propietaria de HORIBA permite un sistema de imagen sencillo, pero muy preciso, sin que nada se mueva salvo un espejo de escaneo.
La rotación de este espejo permite seleccionar el ángulo de trabajo relativo al ángulo de resonancia para las mediciones cinéticas. Los ángulos de trabajo (posiciones en las que se registrarán las curvas cinéticas) se eligen en la pendiente más alta de la curva de reflectividad.
Las mediciones cinéticas consisten en monitorizar las variaciones de reflectividad en el tiempo simultáneamente, en hasta varios cientos de puntos.
Con los sistemas clásicos de SPR, solo es posible monitorizar unas pocas interacciones en paralelo. Los sistemas de imagen permiten monitorizar hasta varios cientos de interacciones en paralelo gracias a una celda de flujo especial.
El número de canales corresponde al número de ligandos diferentes que puedes inmovilizar. Los ligandos quedan inmovilizados en el sistema, utilizando el sistema de microfluídica. La microfluídica requiere menos volumen de muestras, pero tiene limitaciones para algunas aplicaciones (suero, plasma, células, etc.). Nuestra configuración fluídica permite el estudio de muestras de crudo sin arriesgar el atasco de la celda de flujo ni las partes fluídicas.
Además, el acoplamiento con otras técnicas, como la espectrometría de masas, es más complicado con sistemas de canales. De hecho, la muestra debe recuperarse varias veces y reconcentrarse, aumentando los pasos experimentales, lo que supone el riesgo de contaminación y/o pérdida de la muestra. HORIBA instrumentos hacen que SPRi-MS sea rápido y sencillo. De hecho, el diseño de un biochip dedicado permite identificar analitos directamente en el biochip sin necesidad de un paso de recuperación.
Fig.8: Formato multiplex.
Formato multiplex
En el mismo biochip (96 puntos) 21 moléculas diferentes (A->U) a 4 concentraciones (1-> 4) y 3 controles negativos diferentes (X-> Y) a 4 concentraciones (1-> 4)->84 interacciones diferentes en paralelo.
Con los sistemas clásicos de SPR, solo es posible monitorizar unas pocas interacciones en paralelo. Los sistemas de imagen permiten monitorizar hasta varios cientos de interacciones en paralelo gracias a una celda de flujo especial.
Formato del canal
En un biochip, solo se pueden inmovilizar 3 moléculas diferentes a 1 concentración y 1 control negativo. En formato de 4 canales, solo se pueden monitorizar 3 interacciones en paralelo. Para 84 interacciones, se necesitan > 28 biochips.
Comparación entre multiplex y formatos de canal:
Un día laborable con nuestros instrumentos SPRi equivale a 3 meses laborables con un instrumento tipo canal.
La información de alto rendimiento se recupera en una sola ejecución. Por ejemplo, con un solo SPRi-Biochip, es posible optimizar las condiciones experimentales para la interacción (concentración de inmovilización, pH de inmovilización, tampón de inmovilización, etc.) y/o filtrar diferentes ligandos simultáneamente. La multiplexación te permite ahorrar tiempo y reducir los costes de los consumibles.
Visualización de todos los puntos del biochip (imagen de la celda de flujo) y los puntos donde ocurren las interacciones tras la inyección del analito (imagen diferencial).
La imagen permite monitorizar simultáneamente las condiciones de resonancia en toda la superficie del biochip gracias a la cámara. Es posible visualizar todos los puntos del biochip (imagen de la celda de flujo) y los puntos donde ocurren las interacciones tras la inyección del analito (imagen diferencial).
En nuestra configuración, los ligandos deben inmovilizarse fuera del instrumento SPRi con un observador automático o manual porque trabajamos en formato de matriz y la configuración fluídica no permite crear manchas en la superficie del biochip dentro del instrumento SPRi. Mientras que con el aparato clásico SPR, los ligandos se inyectan en el sistema SPR y se inmovilizan directamente en los canales. Este spotting en formato microarray permite una inmovilización de ligandos de mayor rendimiento.
El uso de macrofluídicos permite analizar soluciones complejas y muestras de crudo. Esto abre la vía para la explotación de nuevas aplicaciones y para analizar muestras como hibridoma, suero 7,8, saliva 9, leche 10...
Imagen del SPRi-Biochip manchado. Las manchas enmarcadas en amarillo corresponden a la biomolécula estudiada manchada en diferentes concentraciones, y las manchas enmarcadas en rosa corresponden a moléculas de referencia manchadas en diferentes concentraciones (véase más detalles en la nota técnica TN0111).
En lugar de inyectar diferentes concentraciones de analito (análisis "clásico"), inmovilizamos diferentes concentraciones de ligandos en la superficie del biochip e inyectamos el analito a una concentración (análisis "inyección única"). El software dedicado permite determinar constantes cinéticas y calcular la afinidad de la interacción.
No, porque los ligandos suelen estar fijados covalentemente al SPRi-Biochip y no pueden ser retirados. Sin embargo, es posible inyectar muchas muestras diferentes sobre la misma superficie SPRi-Biochip, gracias a la solución de regeneración.
Este paso implica romper la unión específica entre ligando y analito. Se pueden utilizar las siguientes soluciones dependiendo de las biomoléculas estudiadas:
Nuestras superficies SAM y 3D están diseñadas para tolerar estas soluciones de regeneración, y con los ligandos correctamente anclados a la superficie del sensor, se hacen posibles varios pasos sucesivos de interacción-regeneración. El número de regeneraciones depende de la afinidad entre el ligando y el analito, y de la robustez de los ligandos.
Un experimento SPR se realiza en una solución tampón. La solución de amortiguador circula continuamente dentro del instrumento. Según el estudio de interacción ligando/analito, se espera que la composición del buffer en funcionamiento mejore la unión específica. Se recomiendan buffers salados como PBS, HEPES o citrato. La composición, concentración o pH del tampón deben ajustarse según las biomoléculas estudiadas.
Es posible detectar moléculas pequeñas hasta unos 200 Da (detección directa). Sin embargo, la detección exitosa de una molécula pequeña depende del modelo de interacción y de las condiciones experimentales.
Detección de moléculas pequeñas (curvas cinéticas y determinación de afinidad). Los experimentos se realizaron con un CMD Biochip y el SPRi-CFM.
Detección de moléculas pequeñas (curvas cinéticas y determinación de afinidad). Los experimentos se realizaron con un CMD Biochip y el SPRi-CFM.
Fig. 12-13: Detección de moléculas pequeñas (curvas cinéticas y determinación de afinidad). Los experimentos se realizaron con un CMD Biochip y el SPRi-CFM.
La solución de la muestra se inyecta utilizando un sistema fluídico clásico (sin microfluídica); Por tanto, es posible inyectar soluciones de muestra altamente concentradas como suero, lisados celulares y plasma.
También es posible inmovilizar proteínas de una muestra cruda en la superficie del biochip con buena especificidad gracias a un anticuerpo de captura y a un paso eficiente de reticulación para evitar el desacoplamiento de la proteína de la superficie del biochip durante el paso de regeneración. A esto lo llamamos inmovilización multipasos por localización.
Acoplamiento entre SPRi y MALDI-MS (desorción-ionización-tiempo de vuelo asistido por láser por matriz (MALDI-ToF).
El acoplamiento entre SPRi y MALDI-MS (desorción-ionización-Tiempo de vuelo asistido por láser por matriz (MALDI-ToF)) es muy sencillo. Es posible realizar ambos análisis en la misma diapositiva SPRi.
Tras la interacción SPRi usando nuestros sistemas (usando condiciones compatibles con MS, es decir, buffer, química, etc...), la lámina SPRi se elimina del sistema SPRi. La deposición de matriz y la digestión enzimática ocurren en cada punto individual. Después, la lámina SPRi se coloca sobre el soporte de placa MALDI y se realiza un análisis de masa directamente sobre la superficie del chip. No es necesario un procedimiento largo de elusión que pueda causar pérdida de material o contaminación de muestras 16,17, 18, 19.
MALDI-MS es adecuado para glicanos, análisis de masas peptídicas, proteínas pequeñas o digeridas, polímeros, ADN o cualquier compuesto orgánico.
Podemos caracterizar con éxito proteínas y péptidos emitidos de proteínas digeridas in situ.
Cada paso del experimento SPRi-MS se realiza sobre la misma superficie de diapositiva SPRi. De hecho, la superficie de deslizamiento SPRi se utiliza para la inmovilización de ligandos, captura de analitos específicos, digestión in situ (si es necesario) y análisis MALDI-MS.
