Una matriz típica de emisión de excitación (EEM)
Una medición que se está utilizando cada vez más en el campo de la espectroscopía de fluorescencia es la matriz de emisión de excitación, o EEM. Un EEM es un escaneo 3D, que resulta en un gráfico de contorno de longitud de onda de excitación vs. longitud de onda de emisión vs. intensidad de fluorescencia. Los EEMs se utilizan para diversas aplicaciones donde se requiere análisis multicomponente y a menudo se les denomina como la huella molecular de muchos tipos diferentes de muestras.
Some of the first published uses of EEM spectroscopy were in the 1980’s where the technique was used to study tryptophan fluorescence in low density lipoproteins in human blood serum (Koller, 1986) and to investigate fluorescent components in human plasma from tumor patients (Leiner, 1986).
Los fluorómetros de barrido tradicionales no permiten la potencia completa de la identificación molecular de EEM debido a tres limitaciones fundamentales. En primer lugar, los espectrofluorómetros de barrido tradicionales no pueden compensar inherentemente las variaciones en las concentraciones de moléculas fluorescentes de la muestra. El efecto filtro interno (IFE) es un fenómeno bien conocido que distorsiona el espectro de fluorescencia medido de una molécula debido a la absorción que ocurre en concentraciones más altas de la muestra (normalmente superiores a 0,1 a 0,2 unidades de absorbancia). La única forma de corregir IFE con un fluorómetro tradicional es adquirir una medición secundaria en un espectrómetro de absorbancia diferente y ajustar la señal de fluorescencia medida en consecuencia. Pero esto también es muy complicado, ya que la medición no ocurre simultáneamente y con los mismos volúmenes exactos. Por ello, los fluorómetros de barrido tradicionales carecen de verdadera independencia de concentración, lo que limita severamente la capacidad de un EEM tradicional para identificar con precisión muchas muestras.
En segundo lugar, dado que los fluorómetros miden por definición la fluorescencia, les falta información importante de absorbancia y color para todas las moléculas no fluorescentes, lo que puede ser una parte crítica de una identificación molecular integral y multicomponente.
Un desarrollo reciente, adquisición simultánea, transmisión y fluorescencia de EEMs (A-TEEM), está disponible en dos espectrofluorómetros de HORIBA y resuelve muchos de los problemas mencionados anteriormente mientras corrige el efecto del filtro interno sobre la marcha. Dado que las mediciones se realizan simultáneamente, no existen variaciones de concentración.
Por último, los instrumentos de escaneo de canal único son muy lentos, requiriendo de varios minutos a una hora para recopilar un conjunto de datos completo. Por ello, los fluorómetros de barrido están limitados a la cantidad de datos de EEM que pueden recoger en un día y también a trabajar solo con muestras que no cambian durante el tiempo de adquisición de EEM.
La precisión de la fluorescencia EEM, sin corrección IFE, está limitada a muestras con concentraciones solo en valores de absorbancia inferiores a aproximadamente 0,1-0,2. Para acceder al verdadero poder de los EEMs de fluorescencia es necesario emplear métodos de software multivariante como el Análisis de Componentes Principales (PCA), el método clásico de mínimos cuadrados (CLS) y el Análisis de Factores Paralelos (PARAFAC).
El efecto del filtro interno
El efecto filtro interno se compone de dos procesos: el Efecto de Filtro Primario (PIF), donde la intensidad de la luz de excitación disminuye gradualmente debido a la absorción en función de la longitud del camino óptico de la muestra líquida antes de alcanzar el volumen fluorescente, y el Efecto de Filtro Secundario (SIF), donde la intensidad de fluorescencia emitida disminuye debido a la reabsorción incluso por la parte de la muestra que no es excitada directamente por el haz de excitación.
Consecuencia espectral del efecto del filtro interno
Los EEMs se utilizan cada vez más para el análisis de calidad del agua, específicamente para el estudio de materia orgánica disuelta cromofórica, también llamada CDOM. La materia orgánica disuelta incluye aminoácidos, ácidos húmicos, ácidos fúlvicos y otros ejemplos de materia en descomposición en fuentes de agua naturales, o subproductos de desinfección de procesos de tratamiento de agua.
Los EEMs se utilizan para identificar la presencia de cada uno en concentraciones muy bajas, normalmente en el rango de ppb. La instrumentación para esta aplicación mide idealmente tanto el espectro de fluorescencia como la absorbancia simultáneamente.
Debido a que la fluorescencia es lineal y la concentración solo en valores de absorbancia inferiores a aproximadamente 0,1-0,2, las muestras de mayor absorción deben usar correcciones a la intensidad de fluorescencia para efectos de filtro interno mediante la medición y aplicación del espectro de absorbancia UV-visible.
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