Équation d'anisotropie
L'anisotropie de fluorescence, ou polarisation de fluorescence, mesure le changement d'orientation d'une molécule dans l'espace, en fonction du temps écoulé entre l'absorption et l'émission. L'absorption et l'émission indiquent l'alignement spatial des dipôles de la molécule par rapport au vecteur électrique de l'onde électromagnétique d'excitation et de la lumière émise, respectivement. Autrement dit, si la population de fluorophores est excitée par une lumière polarisée verticalement, la lumière émise conservera une partie de cette polarisation en fonction de sa vitesse de rotation en solution. Plus le mouvement d'orientation est rapide, plus la lumière émise sera dépolarisée. Plus le mouvement est lent, plus la lumière émise conservera sa polarisation.
Représentation d'une expérience d'anisotropie de fluorescence utilisant des polariseurs d'excitation et d'émission tournés vers des orientations de 0 degré (vertical, V) et 90 degrés (horizontal, H).
Pour exploiter ces informations, des polariseurs sont placés sur le trajet d'excitation et sur le trajet d'émission d'un fluorimètre. L'anisotropie est calculée en prenant le rapport des intensités dans l'équation ci-dessus, où I(VV) indique l'intensité avec une excitation polarisée verticalement et une polarisation verticale sur l'émission détectée. I(VH) indique l'intensité avec un polariseur vertical sur l'excitation et un polariseur horizontal sur l'émission. G est un facteur de réseau utilisé pour corriger la transmission différentielle des deux orientations vectorielles orthogonales de l'instrument.
Quelques équations utiles pour appliquer l'anisotropie, r et l'anisotropie résolue dans le temps, r(t).
Comment se déroule l'expérience ? La fluorescence est d'abord mesurée avec le polariseur d'excitation et le polariseur d'émission réglés verticalement. L'intensité I(VV) est introduite dans l'équation d'anisotropie. La mesure est ensuite répétée avec le polariseur d'émission réglé horizontalement et l'intensité I(VH) est introduite dans l'équation.
La formule d'anisotropie contient un facteur de 2 car il existe deux orientations orthogonales sur lesquelles la déviation du vecteur VVz peut être projetée, Hx et Hy, ce qui donne deux composantes I(VH).
Une expression apparentée, le degré de polarisation p, est souvent utilisée pour décrire un paramètre de polarisation bidimensionnel ne prenant en compte qu'une seule composante horizontale. Dans ce dernier cas, la formule ne comporterait pas le multiplicateur 2 pour I(VH), p remplaçant r.
Mesure de l'anisotropie résolue dans le temps
Ensuite, le facteur G est calculé en mesurant l'intensité à HH et HV et en insérant I(HV) et I(HH) dans l'équation de G. L'anisotropie, désignée par la lettre minuscule « r », est souvent utilisée comme indicateur de la taille moléculaire, de la diffusion et de la viscosité.
Dépliage induit par la température de la protéine BSA surveillé par l'anisotropie de fluorescence des résidus de tryptophane intrinsèques
Voici quelques équations utiles pour analyser les résultats d'anisotropie. L'équation d'anisotropie de base a déjà été abordée, mais elle peut être calculée pour des désintégrations de fluorescence complètes, ce qui donne une anisotropie résolue en temps. À partir de cette anisotropie, on peut obtenir des constantes de temps de réorientation, puis utiliser les équations de Perrin et de Stokes-Einstein-Debye pour estimer des propriétés telles que le coefficient de diffusion, la viscosité locale et les volumes moléculaires.
Ces informations correspondent à des informations très importantes lors de l'examen d'applications telles que la liaison protéique ou moléculaire, l'agrégation de polymères et d'autres études environnementales locales dans des solutions et des matériaux complexes.
À titre d'exemple, on peut clairement observer le comportement du dépliement protéique de la BSA en fonction de la température, mesuré par anisotropie de fluorescence. L'anisotropie des résidus de tryptophane intrinsèque est utilisée dans ce cas.
Les taux de réaction de la liaison de la thiamine et du mercure pour former du thiachrome sont déterminés en faisant varier la concentration de thiamine utilisée.
La cinétique de fluorescence désigne l'observation de l'intensité de la fluorescence au fil du temps. Dans ce cas, un échantillon est excité à une longueur d'onde unique et l'émission est détectée à cette longueur d'onde unique au fil du temps. Parfois, des paires de longueurs d'onde sont utilisées pour les colorants ratiométriques ou pour enregistrer simultanément des informations de base ou de bruit de fond.
Les vitesses de réaction peuvent être suivies grâce à des mesures temporelles, comme illustré ici. Dans cet exemple, les vitesses de réaction de la liaison de la thiamine et du mercure pour former du thiachrome sont déterminées en faisant varier la concentration de thiamine utilisée. Chaque analyse cinétique représente une vitesse de réaction différente pour la formation du thiachrome.
La liaison d'un fluorophore appelé ANS à une protéine, BSA.
La cinétique de fluorescence est souvent mesurée à l'aide d'un accessoire de mélange rapide appelé flux stoppé. Ce flux stoppé mélange deux solutions ou plus en quelques millisecondes, ce qui permet d'enregistrer la liaison ou la réaction au plus près du temps de mélange zéro, sans effets de diffusion.
La liaison d'un fluorophore appelé ANS à une protéine, la BSA, est illustrée ici. La fluorescence de l'ANS augmente lors de la liaison ; la vitesse de liaison peut donc être mesurée par cinétique de fluorescence. Dans cet exemple, la liaison de l'ANS à la BSA se produit à une vitesse d'environ 400 millisecondes.
Les bains à circulation et les régulateurs de température Peltier sont deux accessoires permettant de contrôler la température d'un échantillon sur un fluorimètre. Les porte-cuvettes « standard » des systèmes de fluorimètre sont dotés de deux raccords permettant la circulation du liquide, lesquels peuvent être connectés à un bain-marie à recirculation. Ceci permet de réguler des températures comprises entre -40°C et 70°C.
Une autre méthode consiste à utiliser un support de cellule à effet Peltier, plus réactif qu'un bain-marie, et permettant de réguler des températures comprises entre -25°C et 105°C. La différence réside dans le fait qu'un dispositif Peltier régule la température avec beaucoup plus de précision qu'un mélange en circulation, qui tend à atteindre une température donnée, à la dépasser et à revenir jusqu'à ce qu'elle soit atteinte.
Les bains à circulation sont utiles pour régler et maintenir une température pendant une expérience. Cependant, pour mesurer des échantillons à différentes températures sur une plage donnée, ou pour des échantillons très sensibles aux variations de température, un régulateur de température Peltier est plus pratique. Il est également possible d'utiliser des cryostats et des kits de montage, disponibles pour différents modèles de cryostats à azote liquide et à hélium. Outre le refroidissement, la plupart des cryostats peuvent également chauffer des échantillons à 500 K et plus.
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