La spectroscopie de fluorescence est une méthode d'investigation basée sur les propriétés de fluorescence de l'échantillon étudié et est utilisée pour les mesures quantitatives de produits chimiques.
La spectroscopie de fluorescence analyse la fluorescence d'une molécule en fonction de ses propriétés fluorescentes.
La fluorescence est un type de luminescence provoqué par des photons excitant une molécule, l'élevant à un état électronique excité.
La spectroscopie de fluorescence utilise un faisceau lumineux qui excite les électrons des molécules de certains composés et les fait émettre de la lumière. Cette lumière est dirigée vers un filtre, puis vers un détecteur, pour mesurer et identifier la molécule ou ses modifications.
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Le terme fluorescence désigne un type de luminescence. Au sens large, la luminescence est l'émission de lumière par une molécule. Il existe plusieurs types de luminescence.
La photoluminescence se produit lorsque l’énergie lumineuse, ou les photons, stimulent l’émission d’un photon.
La chimioluminescence est définie comme la stimulation par l'énergie chimique de l'émission d'un photon, et cela inclut la bioluminescence, comme on l'observe chez les lucioles et de nombreuses formes de vie marine.
L'électroluminescence se produit lorsque l'énergie électrique ou un champ électrique puissant stimule l'émission d'un photon, comme dans certaines applications d'éclairage.
La fluorescence, plus précisément, est un type de photoluminescence où la lumière élève un électron vers un état excité. Cet état excité subit une perte rapide d'énergie thermique vers l'environnement par vibrations, puis un photon est émis depuis l'état excité singulet le plus bas. Ce processus d'émission de photons entre en compétition avec d'autres processus non radiatifs, notamment le transfert d'énergie et la perte de chaleur.
Lorsque le terme « fluorescence » est utilisé, les mêmes méthodes de mesure peuvent généralement être appliquées à l’une des catégories de luminescence ci-dessus.
Les spectres d'émission et d'excitation d'un fluorophore donné sont des images miroir l'un de l'autre
On parle de spectre de fluorescence à l'état stationnaire lorsque des molécules, excitées par une source lumineuse constante, émettent de la fluorescence. Les photons émis, ou intensité, sont détectés en fonction de la longueur d'onde. Un spectre d'émission de fluorescence est obtenu lorsque la longueur d'onde d'excitation est fixe et que la longueur d'onde d'émission est balayée afin d'obtenir un graphique intensité/longueur d'onde d'émission.
Un spectre d'excitation de fluorescence est obtenu lorsque la longueur d'onde d'émission est fixe et que la longueur d'onde du monochromateur d'excitation est balayée. Ainsi, le spectre renseigne sur les longueurs d'onde auxquelles un échantillon absorbera pour émettre à la longueur d'onde d'émission unique choisie pour l'observation. Analogue au spectre d'absorption, il s'agit d'une technique beaucoup plus sensible en termes de limites de détection et de spécificité moléculaire. Les spectres d'excitation sont spécifiques à une seule longueur d'onde/espèce émettrice, contrairement au spectre d'absorption, qui mesure toutes les espèces absorbantes d'une solution ou d'un échantillon. Les spectres d'émission et d'excitation d'un fluorophore donné sont des images miroir l'un de l'autre. Généralement, le spectre d'émission se produit à des longueurs d'onde plus élevées (énergie plus faible) que le spectre d'excitation ou d'absorption.
Ces deux types de spectres (émission et excitation) permettent d'observer l'évolution d'un échantillon. L'intensité spectrale et/ou la longueur d'onde du pic peuvent varier en fonction de facteurs tels que la température, la concentration ou les interactions avec d'autres molécules environnantes. Cela inclut les molécules extinctrices et les molécules ou matériaux impliquant un transfert d'énergie. Certains fluorophores sont également sensibles aux propriétés du solvant, telles que le pH, la polarité et certaines concentrations ioniques.
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Spectres d'émission de fluorescence de certains fluorophores courants dans le spectre UV et visible.
Les molécules et matériaux fluorescents sont de toutes formes et de toutes tailles. Certains sont intrinsèquement fluorescents, comme la chlorophylle et les résidus d'acides aminés tryptophane (Trp), phénylalanine (Phe) et tyrosine (Tyr). D'autres sont des molécules synthétisées spécifiquement comme colorants organiques stables ou marqueurs, destinés à être ajoutés à des systèmes non fluorescents. Il en existe des catalogues complets. Généralement, les molécules fluorescentes organiques contiennent des cycles aromatiques et des électrons pi-conjugués. Selon leur taille et leur structure, les colorants organiques peuvent émettre de l'UV vers le proche infrarouge.
Voici un échantillon aléatoire de quelques fluorophores courants couvrant les spectres UV et visible. Certains éléments des terres rares, ou lanthanides, possèdent des orbitales électroniques supérieures, où les électrons se déplacent, sous l'effet des transferts de charge des ligands métalliques, entre les orbitales 4f-5d et même 4f-4f. (Bunzli, 1989) De nombreuses molécules sont naturellement luminescentes, comme certains acides aminés, les chlorophylles et les pigments naturels. D'autres sont hautement manufacturées pour des applications très spécifiques de la spectroscopie de fluorescence.
Quelques-unes des catégories de molécules et de matériaux fluorescents sont :
D'autres molécules et matériaux, tels que les protéines fluorescentes, les semiconducteurs, les phosphores et les terres rares, font partie des échantillons fluorescents couramment utilisés. Les polymères contenant des aromatiques conjugués ou des diènes présentent également fréquemment des propriétés fluorescentes. Bien entendu, de nouveaux matériaux sont constamment créés.
Pour en savoir plus sur la spectroscopie de fluorescence, veuillez lire le livre du Dr Joseph Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, troisième édition.
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