A-TEEM Molecular Fingerprinting

A-TEEM 光谱技术

A-TEEM (Absorbance-Transmission fluorescence Excitation and Emission Matrix )技术可同时提供吸光度-透射荧光激发和发射矩阵采集。 是用于定量分子指纹,快速、低成本的光学技术,具有高特异性和灵敏度。

A-TEEM分子指纹图谱简介

A-TEEM分子指纹图谱是什么?

A-TEEM™分子指纹技术是一种新的光学技术,适用于水、葡萄酒,药品等多种领域的QC/QA综合成分分析。它是一种简单、快速、“无栏”的光谱技术,可以同时测量溶液中样品的吸光度、透射率和荧光光谱,比传统的分析技术(如色谱、质谱、红外等)都具有独特的优势。从根本上说,这项技术最适用于溶液中含有荧光成分的样品分析,比如芳香族分子。目前,荧光EEM指纹技术也已应用于固体和皮肤。与吸光度、FTIR和拉曼等其他光谱技术相比,荧光技术是一种高灵敏度的技术,数据的三维性质为复杂成分分析提供了更好的基础。

A-TEEM光谱技术是指同时获取特定样品的吸光度透射率荧光激发发射三维矩阵(EEM)的能力。HORIBA凭借Aqualog专利系统开发了这项技术,该系统将A-TEEM光谱技术与多通道CCD检测相结合,提供了极其快速及准确的A-TEEM测试结果。

除了可能进行简单的稀释外,A-TEEM光谱测试不需要其他复杂的样品制备,同时由于A-TEEM光谱仪的低成本及操作简便等特点,使得其既可以用于研究实验室,也可以用于在线生产过程。对于溶液中荧光组份的分析,这是一种更简单、更快、更便宜且无栏的技术分析解决方案。A-TEEM已将荧光光谱技术从研究实验室引入工业QC/QA综合成分分析的应用中。

HORIBA A-TEEM技术荧光光谱仪可用于荧光EEMs测试,也可用于以吸光度数据进行的多组分分析,以及以透射数据进行的CIE测试。

吸光度
蒽的吸收光谱

蒽的吸收光谱

透光率/颜色
CIE chromaticity plot of various wines

不同种类酒的CIE坐标图

荧光A-TEEM分子指纹图谱
ROMi1细胞培养基的A-TEEM分子指纹图谱(Aqualog测试结果)

ROMi1细胞培养基的A-TEEM分子指纹图谱(Aqualog测试结果)

A-TEEM光谱的独特优势源于仪器采集的三维荧光光谱EEMs时对內滤效应进行了校正。这意味着其在更广泛的浓度范围(通常高达~2吸光度单位)内真实而准确地表达了感兴趣的分子信息。因此,与从传统的荧光谱仪采集的EEM相比,A-TEEM具有更精确的分子指纹识别功能。

A-TEEM光谱技术将荧光技术带入了真正的分析市场。已经证明,在某些情况下,A-TEEM光谱技术作为一种更简单、更快和更便宜的分析工具,可以取代传统的仪器(如高效液相色谱或质谱仪)。

HORIBA A-TEEM数据使用Eigenvector Research Incorporated公司的Solo Predictor进行分析。为了对荧光A-TEEM光谱数据进行更深入的分析,需要使用主成分分析(PCA)、经典最小二乘法(CLS)、平行因子分析(PARAFAC)等多元分析方法(化学计量学)对三维数据集进行成分和浓度分析。利用大量样本数据创建一个模型,然后可以使用化学计量学来获得单个样本中每种成分的占比。

荧光是一种高灵敏测试技术,三维A-TEEM分子指纹图谱技术可以通过激发和发射特性的变化,来展示和区分分子结构的细微变化。

尽管图中所示三维A-TEEM分子指纹图谱看起来非常相似,但其可以通过化学计量学软件进行分析和区分(数据由Aqualog获得)

A-TEEM与传统EEM

传统的扫描式荧光分光光度计以采集荧光激发发射三维矩阵(EEM)的形式来获得分子指纹图谱,也被称为3D荧光光谱。EEM是荧光强度随荧光激发波长、荧光发射波长变化而变化的三维数据集。传统扫描式荧光光谱仪是通过在不同激发波长下顺序扫描一系列发射光谱来获得的,然后将数据集进行三维重建。该三维数据集可利用第三方多元分析软件进行成分分析,也可与其他分析技术如FTIR、HPLC和MS一起使用。许多已发表的科学论文引用了传统扫描式荧光分光光度计获得的EEM数据进行成分分析的结果,包括食品科学、水环境和制药等众多科学应用领域。

然而,使用传统扫描式PMT荧光光谱仪进行EEM成分研究时有两个局限性。首先,用扫描式荧光光谱仪采集单个EEM需要很长时间。根据信号强弱,以及所需的波长范围和分辨率不同而有所区别。有时单个EEM实验需要扫描式荧光光谱仪长达一小时的时间的采集时间!

扫描式荧光光谱仪的另一个重要限制是,所获得的EEM指纹图谱的形状会随着样品浓度的细微变化而变化。若仪器测量同一分子不同浓度下的EEM指纹图谱时获得不同结果,那么它就不能用于成分分析。EEM若作为一种分析技术,其谱图的形状必须与浓度无关。

扫描式荧光光谱仪的局限性限制了荧光EEM技术的可用性,从而促使HORIBA开发了A-TEEM技术。

HORIBA独特的A-TEEM技术克服了这两个局限性。通过CCD检测技术,HORIBA解决了扫描式荧光光谱仪的速度限制,通过HORIBA的CCD采集技术,单个荧光EEM可以在几秒到几分钟内获得。

Three dimensional contour plot viewed at an angle of fluorescence EEM

图 1. 以荧光 EEM 角度观察的三维轮廓图,三维轴表示荧光激发、发射和强度。

Contour plot (top down view) of fluorescence EEM

图 2. Duetta 在一秒钟内获得的荧光素荧光 EEM 的轮廓图(自上而下视图)。

其次,HORIBA利用A-TEEM技术在采集荧光的同时也采集同一样品的吸光度这一事实,解决了荧光内滤效应相关的问题,并获得利用吸光度来校正内滤效应(IFE)的EEMs。

HORIBA将这种技术称为A-TEEMTM,即吸收-透射激发发射三维矩阵。通过校正内滤效应,A-TEEM分子指纹图谱更准确的代表了真实的分子指纹图谱。因此,当使用第三方多元化学计量学分析软件分析时,A-TEEM数据提供的成分分析比扫描式荧光光谱仪的简单EEM数据更可靠。

下面是一个很好的例子,说明单个分子中即使是很小的浓度差异,也会对EEM指纹图谱的形状产生显著影响,但通过适当的IFE校正,A-TEEM指纹图谱则不随浓度的改变而改变。

Fluorescence EEMs of two concentrations of quinine sulfate

图1 0.1 M高氯酸(aq)稀释的两种浓度硫酸奎宁校正内滤效应前后的荧光激发发射三维矩阵,(数据由HORIBA Duetta获得)。

本文介绍的Aqualog A-TEEM数据的化学计量学分析方法使用Eigenvector Research Incorporated公司的Solo软件。

 

A-TEEM应用

水环境中的A-TEEM应用

制药领域的A-TEEM应用

葡萄酒和烈酒领域的A-TEEM应用

化妆品领域的A-TEEM技术应用

橄榄油领域的A-TEEM应用

水环境中的A-TEEM应用

2010年HORIBA Aqualog荧光光谱仪的发明首次引入了A-TEEM技术。最初被设计为一种更准确、更灵敏和更快速的水质分析光谱解决方案,专门用于研究可溶性有机物,即CDOM。可溶性有机物包括氨基酸、腐殖质、富里酸和其他自然水源中的腐坏物质,或水处理过程中的消毒副产品。在Aqualog诞生之前,科学家使用传统的扫描式荧光光谱仪进行CDOM研究,扫描速度非常慢,而且不能提供与浓度无关的荧光EEM指纹图谱。现在,HORIBA Aqualog作为水环境研究的黄金标准,不仅是CDOM,还包括许多其他物种。目前,Aqualog作为一种简单、快速的早期预警监测仪被用于世界各地的水处理厂,并通过优化化学处理来节省资金。

Common fluorescent compounds in water include humic acids, fulvic acids, and amino acids

水中常见的荧光化合物包括腐殖质,富里酸和氨基酸(废水)等物质,可以通过PARAFAC分析不同水处理过程中的A-TEEM分子指纹图谱进行研究。(数据由Aqualog获得)

CDOM的大部分组分在紫外和可见光范围内的激发发射光谱有明显的重叠。通过获得大量样本测试数据,进行模型创建,然后使用化学计量学软件来获得单个样本中每种成分的分数。荧光A-TEEM技术的独特之处在于它可以校正IFE,从而获得精确的分子指纹图谱。该3D荧光分析方法,可以很容易地通过跟踪发射光谱、激发光谱或两者的变化来获得水环境组分变化的信息。

Aqualog A-TEEM技术应用于水环境研究实验室

Aqualog A-TEEM荧光光谱仪比通过传统扫描式PMT荧光光谱仪获得EEM图谱要更快并且更准确,对于可溶解有机物(CDOM), Aqualog A-TEEM技术荧光光谱仪是一款更快更好的光谱仪。Aqualog已经被用于一些著名的水环境研究实验室,并且由于其强大的稳定性,可带至偏远地区,进行各种重要课题的研究。

水环境研究热点领域:可溶解有机物(CDOM)及其衍生物DOM和NOM。

Aqualog A-TEEM技术应用于饮用水处理厂

Aqualog用于饮用水处理厂监测和跟踪三个关键的不同来源水的参数:进入工厂的原水;沉淀后的沉淀水;以及进入饮用水供应系统的成品水。关键参数包括:

  • THM物种
  • THMFP
  • DOC
  • SUVA
  • A254
  • 芳香性指数

 

想要了解更多关于A-TEEM分子指纹图谱技术如何帮助您的应用研究,请发邮件至a-teem.us@horiba.com

制药领域的A-TEEM应用

2010年HORIBA Aqualog荧光光谱仪的发明首次引入了A-TEEM技术。最初被设计为一种更准确、更灵敏和更快速的水质分析光谱解决方案。现在,Aqualog被用于许多工业QC/QA应用。在制药行业,Aqualog有两个独特的应用。一是上游采用A-TEEM指纹图谱技术监测细胞培养基。另一个是在下游使用A-TEEM技术来验证包装疫苗。在这两种应用中,Aqualog提供了一种简单快速的光学方法,与传统的分析方法相比,可以为制药公司节省大量资金。Aqualog在制药行业的大部分工作都受到保密协议的保护,但是关于这些应用的某些信息是可以共享的。

监测细胞培养基

随着利用哺乳动物细胞培养生产蛋白质的兴起,在生产过程中控制细胞培养基的质量变得越来越重要。用于生物反应器的细胞培养基通常为水溶液,并提供细胞最优生长所需的一切物质。即使成分的细微变化也会对细胞培养的生长速度和产量产生明显的影响。因此,必须严格控制生物反应器中细胞培养基的组成和质量,以保持最佳的生物反应器过程。因此,鉴定和分析细胞培养基是非常重要的。荧光光谱方法由于其检测速度快、样品处理要求低、以及与质谱和色谱相比成本相对较低,制药行业已开始转向荧光等光谱方法来分析细胞培养基。

为了保持最佳的生物反应器过程,必须严格控制生物反应器中细胞培养基的组成和质量。因此,鉴定和分析细胞培养基质量的方法已成为该领域的重要研究热点。

细胞培养基常用的Aqualog测量
荧光物质吸收物质颜色

Amino Acids

Nucleotides

 

Tryptophan

Proteins

 

Phenylalanine

Biomass

 

Tyrosin

 

 

NAD(P)H

 

 

FAD/FMN

 

 

Pyruvate

 

 
细胞培养基QC/QA监测过程种A-TEEM技术优势
  • A-TEEM技术可在数秒到几分钟内提供全面的分子指纹图谱
  • A-TEEM技术不需要泵、色谱柱或溶剂,且样品制备简单
  • 信息丰富,可兼容搭配多种多变量分析软件
  • 理想的成分回归(化学计量学)
  • 理想的细胞培养基分类
  • 区分组分的的变化
    • 曝光度
    • 氧化
    • 细胞代谢

近年来,A-TEEM技术与某些化学计量学方法(PARAFAC、PCA)相结合,为鉴定和评估细胞培养基质量提供了一种快速、有效、廉价的方法。

 Examples of cell culture media molecular fingerprint A-TEEMs

图1:细胞培养基A-TEEMs分子指纹图谱示例。图中所示的培养基来自样品DMEM1(左)、HAMSF12(中)和RPMI1(右)(数据由Aqualog获得)。

主要细胞培养基类型和变异的分类研究

使用Aqualog A-TEEM荧光光谱仪,甚至可以识别同一培养基类型的变化。这张图显示了一个由主成分分析(PCA)生成的三个成分的得分图,使用来自三个不同DMEM样本的所有数据(数据由Aqualog获得,并利用Eigenvector 公司的Solo软件进行主成分分析)。

疫苗验证

HORIBA Aqualog可用于根据简单的光学分析获得的细微分子变化来识别不同的疫苗,并不是药效测试。与第三方CFR兼容的软件包一起,Aqualog可应用于疫苗终点验证。

胰岛素的结构和稳定性

胰岛素是一种蛋白质激素,由胰腺产生,是基本代谢过程所必需的。它本质上由可发荧光的氨基酸组成。不同类型的商业治疗胰岛素通常可分为两类:短效胰岛素和长效胰岛素。在某些情况下,短效和长效胰岛素的区别,仅仅是蛋白质序列中的一个、两个或三个氨基酸,A-TEEM分子指纹图谱可以区分这些细微的变化。A-TEEM分子指纹图谱可以监测微小的序列变化导致荧光残基胰岛素蛋白的聚集行为和局部溶剂环境的差异。

来源:“A-TEEM™,一种新的分子指纹图谱技术:一种同时获得吸收-透射和荧光激发-发射三维矩阵的方法”,发表在《荧光方法与应用》第6卷第2期 https://doi.org/10.1088/2050-6120/aaa818. (数据由Aqualog获得)

想要了解更多关于A-TEEM分子指纹图谱技术如何帮助您的应用研究, 请发邮箱至 a-teem.us@horiba.com

葡萄酒和烈酒领域的A-TEEM应用

葡萄酒行业是Aqualog A-TEEM荧光光谱仪量化葡萄酒酚类物质后的早期采用者,因为该技术提供了一种简单、快速的光学方法,与传统的分析方法相比,可以为大型葡萄酒制造商节省大量的时间和金钱。Aqualog在葡萄酒行业的大部分工作都受到保密协议的保护,但也有一些关于该应用领域的信息可以共享。

葡萄酒和烈酒中酚类物质分类

目前,葡萄中已发现数百种不同的化合物,而成熟的葡萄浆果中的酚含量从根本上决定了葡萄酒的品质。不同种类的酚类物质(花青素、单宁、黄酮醇、儿茶素)在不同程度上影响葡萄酒的颜色、口感、风味和香气,而大多数酚类化合物都有荧光。由这些酚类化合物组成的个别化合物共同赋予葡萄酒独特的特性。Aqualog获得的A-TEEM数据用于葡萄酒生产中的上游和下游,以评价葡萄酒不同批次间的、区域和品种的特征。

Classical Least Squared (CLS) analysis of the wines and spirits

基于9种酚类化合物的库,对葡萄酒和烈酒进行经典最小二乘法(CLS)分析,得到它们对总酚类指纹图谱的相对贡献,将所有贡献归一化至100%。葡萄酒和烈酒之间的显著差异可以通过Aqualog获得的酚类化合物指纹图谱上体现出来。

随后应用预定的多元模型,使用参考化合物库进行校准,是对葡萄酒和烈酒进行分类和比较,以检测掺假、变质、烟雾污染、量化二氧化硫处理过程等的快速、简单的技术。

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Fluorescence A-TEEMs for an Italian wine

HORIBA Aqualog测试得到的新鲜的意大利葡萄酒样品(A和C)和进行一周氧化处理之后(B和D)的荧光A- TEEM分子指纹图谱(A和B)和相应的吸光度(OD)和%透射光谱(C和D)。(HORIBA App注:FLSS-38, 2017)

葡萄酒的成分

A-TEEM技术:快速&完整地获得分子指纹图谱

光谱学:60-FAST-01自动进样器

快速自动进样

化妆品领域的A-TEEM技术应用

EEM contour plot of in-vivo forearm skin

图1.活体前臂皮肤EEM图谱(数据由Aqualog获得)

在化妆品行业,Aqualog A-TEEM荧光光谱仪被用于研究皮肤状态和防晒霜的光活性。对于皮肤表征和防晒霜研究,HORIBA Aqualog A-TEEM荧光光谱仪配备了远程光纤探头,从皮肤表面获取荧光激发发射三维矩阵(EEM)。由于这是从固体前表面测量,所以无法进行吸光度检测。

皮肤的内源性荧光是由于特定的荧光团(如卟啉、高级糖基化终产物(AGEs)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、胶原蛋白、弹性蛋白、色氨酸、酪氨酸、NADH嗜黑素、真黑素、脂褐素和角蛋白的成分、血红蛋白(发色团))的存在。荧光EEM可以很容易地识别皮肤内源性标记物并表征与化妆品的相互作用。

防晒霜可以保护皮肤免受自然光中UVA和UVB射线的伤害。它们的特征参数是防晒系数(SPF)。HORIBA Aqualog可以通过在涂抹防晒霜前后获得的EEM图谱变化来研究防晒霜的光活性效应。

防晒霜的主要光过程是吸收:防晒霜吸收到皮肤外层(角质层),起到滤光作用,阻挡紫外线辐射进入皮肤内层,体内荧光衰减反映了所应用化合物实现的保护效果。虽然大部分高能紫外线光子被防晒霜转化、分散或吸收,但仍有一定量的紫外线会进入表皮。

图2.涂抹SPF20 a)和SPF50 b)防晒霜后前臂活体皮肤归一化EEM图谱,可以看到,相对于于未受保护的皮肤,激发光被滤得更多(数据由Aqualog获得)。

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橄榄油领域的A-TEEM应用

在食品工业中,与传统的分析方法相比,Aqualog A-TEEM荧光光谱仪可利用简单、快速和灵敏的光学方法进行橄榄油量化分析。

特级初榨橄榄油(EVOO)是橄榄油的最高质量等级,它经常掺杂较便宜的油(Gurdeniz g .和Ozen B.食品化学116(2009)519-525)。EVOO是由橄榄制成的,在收获后的几个小时内首次冷榨,没有浸泡或任何提取。所有其他的橄榄油成分都不是特级初榨橄榄油。A-TEEM分子指纹图谱技术可以方便地识别和检测掺假产品。

以下是七个商用品牌的EVOO标签的橄榄油和一个品牌的超轻橄榄油(ELT)的A-TEEM分子指纹图谱。

A-TEEM fingerprints of commercial EVO labelled olive oils

图1.叶绿素和降解产物可以很容易地在一些商用EVOO标记的橄榄油的A-TEEM分子指纹图谱中看到(数据由Aqualog获得)。

对A-TEEM数据进行化学计量学分析,可以更详细地分析不同品牌橄榄油的差异。

3-D PARAFAC score plot of edible oils

图2.橄榄油三维PARAFAC得分图。注意右下角的EVOO油分组:左上角的特点是植物油和超轻橄榄油。可以看到,“G”品牌的EVOO和“S”品牌的EVOO与其他的EVOO组的A-TEEM分子指纹图谱是不同的,有可能存在降解产物。

进一步研究这些样本,排除叶绿素发射区域,结合二维PARAFAC得分图,可以揭示额外信息。

2-D PARAFAC scoreplot reveals that brand “A” moved to the region of brand “G” and brand “S”, while the rest of the EVO oils stayed together

图3.二维PARAFAC 得分图显示,A品牌移动到G品牌和S品牌的区域,而其余的EVOO油仍在该得分图的右下角,与上图一致。

通过对A-TEEM分子指纹图谱的偏最小二乘法(PLS)分析,A-TEEM技术还可以定量检测超轻橄榄油的混入比例。

PLS analysis of mixtures of EVO oil

图4.对含有不同ELT比例的EVOO样本的PLS分析,可以看到拟合结果显示了优良的R2值(数据由Aqualog获得)。

同一品牌的同一产品,不同批次间的变化,也可以很好的被检测到。

3-D PARAFAC scoreplot showing lot to lot clustering from a prestigious EVOO brand

图5. PARAFAC三维得分图,可以看到不同时间购买的知名品牌的批次间的变化(数据由Aqualog在同一时间获得)。

用PARAFAC多变量分析方法分析A-TEEM数据中的叶绿素荧光区域(发射波长大于500 nm),可以快速分析给定样品的新鲜度。PARAFAC分析结果可以将A-TEEM分子指纹图谱分解为两个具有明显特征的主要成分,即叶绿素a和脱叶绿素的荧光发射和激发光谱。

Mode 3 loadings corresponding to fluorescence excitation spectra of Pheophytin and Chlorophyll a (Component 1 and Component 2 respectively)

Fig. 6. Mode 3 loadings corresponding to fluorescence excitation spectra of Pheophytin and Chlorophyll a (Component 1 and Component 2 respectively)

图7为Savantes (www.savantes.org)在2019年纽约举行的第五届橄榄油会议品评项目会议上,直接从西班牙和希腊的生产商那里获得的新鲜收获的一组EVOOs的后续分析,并与较早从商店购买的样品进行了对比。可以看到,叶绿素与其降解产物脱叶绿素的相对含量,与产品的新鲜度有关,这是由于包装后,叶绿素即开始转化为脱叶绿素。值得注意的是,对于所有直接采购的EVOOs的样品,由Aqualog同时测量的特征K232和K270值,均符合IOC指导原则(分别低于2.20和0.2)。

Relative content of Chlorophyll and Pheophytin in direct sourced (2019 harvest) and store-bought EVOO’s (2018 and 2017 harvest).

图7.新鲜来源(2019年收获)和从商店购买EVOOs(2018年和2017年收获)中叶绿素和脱叶绿素的相对含量。

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