免标记生物分子相互作用基础

表面等离子共振（SPR）检测偏振光照射到表面覆盖金属薄层的棱镜上时发生的光学过程。在一定条件下（波长、偏振和入射角），SPRi-Biochip 生物芯片金属表面的自由电子吸收入射光光子，并将其转换为表面等离子波。这些等离子波在表面上方约 100 至 200 纳米介质内。在特定入射角（称为共振角）下，等离子波与入射光共振，导致反射率下降。等离子曲线显示探测器收集的反射光随入射角的变化。共振角的位置对 SPRi-Biochip 生物芯片表面的局部环境非常敏感。

SPRi-Biochip 生物芯片表面（约 200 纳米）上的改变，如配体和分析物之间的相互作用，会引起共振条件的变化，这种变化是可以测量的。

等离激元是表征等离子体振荡的物理现象。更准确地说，在物理学中，光波被量化为光子，而等离激元则是等离子体振荡的量化。等离激元是由等离子体振荡量化产生的准粒子。因此，等离激元是自由电子气体密度的集体振荡。它们可以与光子耦合，产生第三个准粒子，称为等离子极化子。

在表面等离激元中，发生的不是气体集体振荡，而是金属传导电子集体振荡。更准确地说，表面等离激元是局限于表面的等离激元，它们与光产生强烈相互作用，产生表面等离极化激元（或表面等离子波）。

通过成像可以同时监测 SPRi-Biochip 整个生物芯片表面的共振情况。当SPRi-Biochip 上固定了不同的分子时（阵列形式），探测器可以并行监控这些不同分子（也称为配体或点样点）上的潜在相互作用。此特性（对微阵列所有点样点的同步测量）也经常被称为多重分析。HORIBA设备成像特性支持多达数百种相互作用的多重测量。

软件处理的流通池图像对应于 SPRi-Biochip 生物芯片表面的实时图像。差减图像显示了注入分析物溶液后相互作用的点样点。

注人样品溶液时，分析物到达流通池时才与配体相互作用。分析物尚未进入流通池的这段时间称为延迟时间（A）。

注入样品后，分析物通过流通池，它们与表面的配体相互作用。这一步称为结合阶段（B）。在结合结束时达到一个平台（C），这可以用分子状态（平衡、饱和或注入体积结束）来解释。当不再有分析物通过流通池时，分析物溶液被缓冲液代替，分析物从固定的配体上解离，这就是解离阶段（D）。

由于部分相互作用具有高亲和力，一些分析物在解离步骤后仍结合在配体上。在此情况下，注入再生液以去除所有剩余分析物。这就是再生步骤（E）。之后可以注入新的样品溶液。

动力学参数

k_a 是结合速率常数（M^-1.s^-1），在某些情况下，也被称为 k_ass,，k_d是解离速率常数（s^-1），在某些情况下，也被称为 k_diss。

SPR 动力学数据（相互作用）建模很简单，可以用于评估两个分子之间的亲和力。通常使用的模型假设反应涉及一种配体（L）和一种分析物（A），它们以 1:1 的化学计量比相互作用：

该模型给出了相互作用动力曲线公式，一个用于结合响应（R_a），一个用于解离响应（R_d），在这类实验中，响应通过反射率变化获取：

R_a(t)=R_eq•(1-exp[-k_obs•(t-t₀)]) (association)

R_d(t)=R_d(t₁) • exp[-k_off•(t-t₁)] (dissociation)

k_obs = k_ass • C_i+k_diss，结合过程的结合速率常数；C_i 为注入的分析物浓度；k_off = k_diss 为解离过程的解离速率常数， t₀ 和 t₁ 分别表示结合和解离的开始时间。

简言之，动力学参数k_ass 和 k_diss通过使用单指数曲线拟合相互作用（结合和解离）的各个部分来计算，推荐使用 ScrubberGen 或 EzFit 软件（基于Scrubber）进行处理。

亲和力参数

K_A 为亲和常数（M^-1）

K_D 为平衡常数（M）

已知动力学参数，可以推导出两个分子之间的亲和常数：

K_A = 1/K_D = k_a/k_d

亲和力参数也可以通过Langmuir拟合由平衡值计算。

热力学参数

ΔG 是吉布斯自由能变

ΔH 是焓变

ΔS 是熵变

由亲和常数（或解离常数）计算得出：

ΔG = R • T • ln(K_D) 

其中 R 是气体常数，T 是绝对温度 (K)，K_D 单位是M。

为计算 ΔH 和 ΔS，必须确定多个温度的亲和力参数。ΔG 由一定温度范围内的 ΔH 和 ΔS 值推导得出。非线性范特霍夫方程被拟合到数据以确定 ΔH 和 ΔS：

已知 ΔG = ΔH-T•ΔS，亦可评估熵变。