What is a Raman Instrument and How Does it Work?

Comprimentos de onda de laser que variam do ultravioleta ao infravermelho próximo, passando pelo visível, podem ser usados para espectroscopia Raman. Exemplos típicos incluem (mas não se limitam a):

• Ultravioleta: 244 nm, 266 nm, 320 nm, 355 nm, 405 nm
• Visível: 458 nm, 473 nm, 515 nm, 532 nm, 594 nm, 633 nm, 660 nm
• Infravermelho próximo: 785 nm, 830 nm, 980 nm, 1064 nm

A escolha do comprimento de onda do laser tem um impacto importante nas capacidades experimentais:

Sensibilidade

A intensidade do espalhamento Raman é proporcional a ^λ⁻⁴, onde λ é o comprimento de onda do laser. Assim, um laser infravermelho resulta em uma diminuição da intensidade de espalhamento por um fator de 15 ou mais, quando comparado com lasers visíveis azuis/verdes.

Resolução espacial                   

O diâmetro do ponto focal do laser, limitado pela difração, pode ser calculado pela equação diâmetro = 1,22 λ/NA (onde λ é o comprimento de onda do laser e NA é a abertura numérica da objetiva do microscópio utilizada). Por exemplo, com um laser de 532 nm e uma objetiva de 0,90/100x, o diâmetro teórico do ponto focal será de 0,72 µm; com a mesma objetiva, um laser de 785 nm produziria um diâmetro teórico de 1,1 µm. Portanto, a resolução espacial alcançável depende, em parte, da escolha do laser. 

Otimização dos resultados com base no comportamento da amostra

Por exemplo:

• Os lasers azuis ou verdes podem ser adequados para materiais inorgânicos e experimentos de ressonância Raman (por exemplo, para nanotubos de carbono e outros materiais de carbono) e para a dispersão Raman intensificada por superfície (SERS).
• A cor vermelha ou o infravermelho próximo (660-830 nm) são bons para suprimir a fluorescência.
• Lasers ultravioleta para ressonância Raman em biomoléculas (como proteínas, DNA e RNA) e supressão de fluorescência.

Os lasers ultravioleta (UV) para espectroscopia Raman normalmente incluem comprimentos de onda que variam de 244 nm a 355 nm.

Teoricamente, a espectroscopia Raman UV não difere da análise padrão usando comprimentos de onda de laser visíveis. No entanto, na prática, existem diversas dificuldades e desvantagens práticas que devem ser consideradas.

Vantagens

• With certain samples, UV laser excitation can interact in ways not possible when using visible laser sources. For example, in semiconductor materials, the penetration depth of UV light is typically in the order of a few nanometers, and thus UV Raman can be used to selectively analyze from a thin top surface layer (as is commonly found in silicon on insulator SOI materials). In another example, UV excitation can give rise to specific resonance enhancement with biological moieties, particularly protein, DNA and RNA structures. Specific analysis of these materials within tissue can be difficult using visible laser wavelengths.
   
• A supressão da fluorescência pode ser frequentemente auxiliada pelo uso de lasers UV, através da separação espectral dos sinais Raman e de fluorescência. Com lasers visíveis, é comum que os sinais Raman e de fluorescência se sobreponham, e a intensidade incomparável da fluorescência é o que pode perturbar (ou mascarar completamente) o espectro Raman. Com a excitação UV, o espectro Raman fica próximo à linha do laser, enquanto a fluorescência é frequentemente deslocada para comprimentos de onda mais altos. Assim, eles deixam de se sobrepor e a fluorescência deixa de ser um problema.
   
• Increased sensitivity can result from UV excitation, since Raman scattering efficiency is proportional to λ^-4 , where λ is the laser wavelength. Thus, Raman scattering at 325 nm is a factor of 14 times more efficient than that at 633 nm.

Desvantagens

• A espectroscopia Raman UV continua sendo uma técnica mais sofisticada que exige maior especialização para ser utilizada. Isso se deve, em parte, ao fato de o feixe de laser ser agora invisível e de os lasers serem maiores, mais complexos e consideravelmente mais caros.
   
• As amostras ficam mais propensas à queima e à degradação pelo feixe de laser, uma vez que a energia por fóton é aumentada. No entanto, novas técnicas, como a óptica DuoScan™, permitem que o feixe de laser seja varrido rapidamente sobre a amostra, evitando assim a queima imediata. Por exemplo, a celulose queima com excitação de 325 nm em poucos milissegundos, mas com o DuoScan™ ela permanece resistente à queima por mais de cinco minutos.
   
• Many Raman systems designed for visible and near infra- red analysis are not suitable for UV Raman. UV Raman requires specific mirror coatings, microscope objectives, diffraction gratings, and a CCD detector for optimized results. Modern systems such as the LabRAM Odyssey can be configured to work efficiently from the UV through to the infra-red without compromise, but nonetheless the additional requirements do come at a cost.

Near infra-red (NIR) lasers for Raman typically include a range of wavelengths greater than 700 nm, such as 785 nm, 830 nm, 980 nm and 1064 nm. The key reason for the use of NIR Raman is for fluorescence suppression, but there are a number of drawbacks which must be considered. Whilst at times NIR Raman is invaluable, it should certainly not be considered the best solution for every sample.

Vantagens

• A supressão da fluorescência pode ser frequentemente auxiliada pelo uso de lasers NIR. A fluorescência é um processo de dois fótons, que primeiro requer a absorção de um fóton, seguida pela emissão de um fóton fluorescente. Por outro lado, o espalhamento Raman é um processo de espalhamento de um único fóton, que não requer absorção. Embora muitos materiais absorvam na região visível, poucos o fazem na região NIR. Assim, em muitos casos, os lasers NIR não induzem fluorescência (já que não ocorre absorção), mas o espalhamento Raman estará presente normalmente. Em casos onde as amostras apresentam forte fluorescência com excitação visível, o Raman NIR pode ser uma solução, permitindo a obtenção de um bom espectro Raman.

Desvantagens

• A diminuição da sensibilidade pode resultar da excitação no infravermelho próximo (NIR), uma vez que a eficiência do espalhamento Raman é proporcional a ^λ⁻⁴, onde λ é o comprimento de onda do laser. Assim, o espalhamento Raman a 785 nm é quase 5 vezes menos eficiente do que a 532 nm. Esse problema é agravado pela diminuição da sensibilidade do detector CCD na faixa Raman do NIR. Consequentemente, os tempos de medição são frequentemente aumentados consideravelmente para se obter qualidade espectral semelhante à das medições realizadas com lasers visíveis.
   
• Os lasers NIR frequentemente apresentam características de feixe (por exemplo, largura e divergência do feixe) que não são tão adequadas para microscopia. Consequentemente, a resolução espacial pode ficar comprometida, e os resultados obtidos podem não corresponder às previsões teóricas.

Existem duas classes principais de filtros usados na espectroscopia Raman.

Filtros ópticos

These optical components are placed in the Raman beam path, and are used to selectively block the laser line (Rayleigh scatter) while allowing the Raman scattered light through to the spectrometer and detector. Each laser wavelength requires an individual filter. There are two main types of filters used, both of which can be used without user intervention or optimization:

• Edge. An edge filter is a long pass optical filter which absorbs all wavelengths up to a certain point, and then transmits with high efficiency all wavelengths above this point. As an example, a 532 nm edge filter will absorb all light up to 533.5 nm or above (e.g., 50 cm^-1 or above) including the laser emission. Above 533.5 nm it will transmit light, allowing detection of the Raman spectrum (stretching from 50 cm^-1 up to 3500 cm^-1 or  above). The edge filters have an ultra steep edge between the absorbing and transmitting spectral region, and offer excellent blocking of the laser line.The advantage of the edge filter is that it is environmentally stable with a near infinite lifetime.
   
• Holographic notch. A notch filter has a sharp, discrete absorption which for Raman is chosen to coincide with a specific laser wavelength. Typically the absorption will be a few nanometers wide (corresponding to a few hundred cm^-1). As an example, for a 532 nm laser, a notch filter will be chosen with a central absorption at 532 nm. The laser line will be absorbed, but the Raman spectrum above will be transmitted. Unlike the edge filter, the notch does have a finite lifetime, and will degrade with time. The advantage of the notch is that it allows measurements to be made for both the Stokes and anti-Stokes Raman scattering, which is useful for certain specialized measurements.
   
• Tunable filtering spectrometer with a triple monochromator instrument, it is possible to work in a ‘double subtractive, single spectrograph’ mode. The first two monochromators are used as an integral pair, which first disperses both the Rayleigh (laser) and Raman scattered light, physically blocks the Rayleigh, and then recombines the light. The third spectrometer then acts in the normal way to disperse the Raman scattered light with subsequent detection. The advantage of using a triple spectrometer in this way is that the laser filter is infinitely variable, and the one instrument can be used to work with any number of laser sources. In addition, the filtering performance is excellent, and allows Raman analysis down to 4-5 cm^-1. However, such an instrument does require rather more expertise to operate compared to the more standard filter based single monochromator systems, and therefore would rarely be considered for routine analysis.

Um CCD (Dispositivo de Carga Acoplada) é um detector de matriz multicanal à base de silício para luz ultravioleta, visível e infravermelha próxima. São utilizados em espectroscopia Raman devido à sua extrema sensibilidade à luz (e, portanto, adequados para a análise do sinal Raman, inerentemente fraco) e por permitirem a operação multicanal (o que significa que todo o espectro Raman pode ser detectado em uma única aquisição). Os CCDs são amplamente utilizados, principalmente como sensores em câmeras digitais, mas as versões para espectroscopia científica são de qualidade consideravelmente superior para oferecer a melhor sensibilidade, uniformidade e características de ruído possíveis.

CCD detectors are typically one dimensional (linear) or two dimensional (area) arrays of thousands or millions of individual detector elements (also known as pixels). Each element interacts with light to build up a charge – the brighter the light, and/or the longer the interaction, the more charge is registered. At the end of the measurement read out, electronics pull the charge from the elements, at which point each individual charge reading is measured.

In a typical Raman spectrometer, the Raman scattered light is dispersed using the diffraction grating, and this dispersed light is then projected onto the long axis of the CCD array. The first element will detect light from the low cm^-1 edge of the spectrum, the second element will detect light from the next spectral position, and so on... the last element will detect light from the high cm^-1 edge of the spectrum.

Os CCDs requerem algum grau de resfriamento para serem adequados para espectroscopia de alta qualidade. Normalmente, isso é feito usando resfriamento Peltier (adequado para temperaturas de até -90 °C) ou resfriamento criogênico com nitrogênio líquido. A maioria dos sistemas Raman utiliza detectores resfriados por Peltier, mas para certas aplicações especializadas, os detectores resfriados por nitrogênio líquido ainda apresentam vantagens.

Um CCD de multiplicação de elétrons (EMCCD) é um tipo especial de detector CCD que utiliza tecnologia de ponta para aprimorar a qualidade do espectro em situações de sinais extremamente baixos. Esse aprimoramento é particularmente valioso quando o sinal Raman é muito fraco, pois o processo de multiplicação de elétrons pode resultar em espectros de boa qualidade, diferentemente dos CCDs convencionais, nos quais apenas algumas das características mais intensas são visíveis acima do ruído. Os benefícios do ganho EM são evidentes na obtenção de imagens espectrais Raman rápidas, onde os curtos tempos de integração necessários podem resultar em sinais que são quase imperceptíveis acima do ruído quando medidos com um CCD convencional.

O EMCCD possui dois registradores de leitura no chip: um registrador convencional e um registrador de multiplicação de elétrons (EM). No registrador EM, as tensões de clock utilizadas são mais altas do que no clock convencional, fazendo com que os elétrons adquiram energia suficiente para que a ionização por impacto ocorra. Nesse ponto, elétrons extras são produzidos e armazenados no próximo pixel. Há apenas uma pequena probabilidade de os elétrons adquirirem energia suficiente para que a ionização por impacto ocorra (criando, assim, elétrons adicionais), mas como o registrador de leitura possui muitos elementos, fatores de ganho significativos são possíveis (até ~1000x). O principal benefício de um EMCCD é que a amplificação ocorre antes da leitura do sinal, o que significa que o sinal não é limitado pelo ruído de leitura. Em outras palavras, por meio da amplificação, o sinal é elevado bem acima do nível de ruído, que é determinado em grande parte pelo ruído da eletrônica de leitura (pré-amplificador e conversor A/D).

A resolução espectral é a capacidade de separar características e bandas espectrais em seus componentes individuais. A resolução espectral necessária para o analista ou pesquisador depende da aplicação em questão. Por exemplo, análises de rotina para identificação básica de amostras geralmente requerem resolução baixa/média. Em contrapartida, a caracterização de polimorfos e cristalinidade frequentemente exige alta resolução, visto que esses fenômenos apresentam apenas mudanças muito sutis no espectro Raman, que não seriam visíveis em um experimento de baixa resolução.

A resolução espectral é um parâmetro experimental importante. Se a resolução for muito baixa, informações espectrais serão perdidas, impedindo a identificação e caracterização corretas da amostra. Se a resolução for muito alta, o tempo total de medição poderá ser maior do que o necessário. O que torna a resolução "muito baixa" ou "muito alta" depende da aplicação específica e das informações que se deseja obter com o experimento.

Normalmente, uma resolução baixa/média é adequada para a identificação química básica e para distinguir diferentes materiais. Uma resolução mais alta torna-se necessária para caracterizar características espectrais mais sutis – por exemplo, pequenas alterações na forma ou na posição de um pico. Existem diversos fenômenos químicos que causam essas alterações espectrais sutis:

• Cristalinidade– Em geral, os picos Raman tornam-se mais nítidos e intensos à medida que um material passa de uma estrutura amorfa para uma cristalina. A alta resolução espectral permite caracterizar até mesmo pequenas alterações na cristalinidade.
   
• Polimorfismo– Polimorfos são materiais que possuem a mesma fórmula química, mas diferentes estados sólidos. Como a fórmula química é idêntica, seus perfis espectrais Raman gerais são semelhantes, mas a influência do estado sólido nas vibrações das ligações individuais causa mudanças sutis no espectro. Portanto, não é inesperado observar pequenas alterações nos formatos e posições dos picos ao longo do espectro.
   
• Tensão/deformação intrínseca– Alguns materiais (principalmente semicondutores) apresentam alterações em seus espectros Raman/fotoluminescência quando submetidos a tensão e deformação. No caso dos semicondutores, a tensão/deformação é cuidadosamente induzida no material para produzir propriedades semicondutoras e/ou luminescentes necessárias para o uso desse material em dispositivos funcionais. A espectroscopia Raman é uma ferramenta essencial para caracterizar a tensão/deformação, mas, frequentemente, o efeito no espectro é sutil – portanto, alta resolução é necessária.
   
• Ligações de hidrogênio– As interações inter e intramoleculares fracas causadas pelas ligações de hidrogênio podem provocar pequenas alterações no espectro Raman e, com alta resolução, o espectro pode ser usado para investigar essas interações.
   
• Enovelamento de proteínas– A estrutura primária de uma proteína terá, obviamente, um impacto significativo nos espectros Raman resultantes, mas as estruturas secundária e terciária, que compreendem o enovelamento localizado e mais disseminado, causam perturbações suficientes nos modos vibracionais para afetar o espectro. Mais uma vez, o efeito será sutil e somente análises de alta resolução permitirão sua caracterização.

A resolução espectral em um espectrômetro Raman dispersivo é determinada por quatro fatores principais. Nas discussões a seguir, o efeito de cada fator é considerado sob a suposição de que todos os outros fatores permanecem inalterados. Na prática, todos esses fatores podem existir em diversas combinações, o que dificulta a comparação direta do desempenho e das capacidades de um sistema.

distância focal do espectrômetro

Quanto maior a distância focal (por exemplo, a distância entre a grade de dispersão e o detector) do espectrômetro, maior a resolução espectral. Espectrômetros Raman típicos possuem distâncias focais que variam de 200 mm (para baixa/média resolução) até 800 mm ou mais (para alta resolução). Às vezes, esquece-se que um espectrômetro com longa distância focal não se limita apenas a trabalhos de alta resolução – com uma escolha adequada de grades (veja abaixo), um espectrômetro de alta resolução pode operar em modo de baixa resolução. Dessa forma, ele é ideal para análises de baixa/média resolução em triagens de rotina, e ainda pode oferecer análises de alta resolução para aplicações mais especializadas.

Rede de difração

Quanto maior a densidade de ranhuras da grade (normalmente medida como o número de ranhuras por milímetro), maior a resolução espectral. As grades típicas usadas para Raman variam de cerca de 300 ranhuras/mm (baixa resolução) até 1800 ranhuras/mm (alta resolução). Grades mais especializadas (incluindo 2400 ranhuras/mm e 3600 ranhuras/mm) também estão disponíveis, mas apresentam certas limitações e não devem ser consideradas de uso geral. O uso de grades com maior densidade de ranhuras não pode ser aplicado indefinidamente para aumentar a resolução espectral, uma vez que elas terão limites práticos e físicos fixos, vinculados ao próprio espectrômetro. Assim, as grades fornecem uma maneira inicial de melhorar a resolução, mas, uma vez atingido seu limite, é necessário utilizar um espectrômetro com maior distância focal.

Comprimento de onda do laser

O poder de dispersão de um par grade/espectrômetro geralmente pode ser considerado constante em termos de comprimento de onda. No entanto, os espectros Raman utilizam uma unidade relacionada à energia (deslocamento Raman, ou número de onda, ^cm⁻¹), o que significa que a resolução espectral diminui à medida que a excitação do laser muda do infravermelho para o visível e, finalmente, para o ultravioleta. Por exemplo, se uma grade de 600 linhas/mm for usada com um laser infravermelho, uma grade de 1200 linhas/mm ou 1800 linhas/mm será necessária com um laser verde para atingir uma resolução semelhante.

Detector

A maioria dos sistemas possui um único detector, portanto, na prática, o usuário não tem controle sobre esse fator. No entanto, é importante observar que diferentes detectores podem ser configurados com diferentes tamanhos de pixel. Quanto menor o pixel, maior a resolução espectral alcançável.

A Raman microscope combines a Raman spectrometer with a standard optical microscope. The excitation laser beam is focused through the microscope to create a micro-spot with a diameter in the order of 0.5-10 µm. The Raman signal from the sample is collected from a similar area, passes back through the microscope into the spectrometer and is there analyzed for spectral information.

O microscópio Raman permite realizar espectroscopia Raman com resolução espacial microscópica. Dessa forma, abre-se uma nova dimensão na análise química:

• Análise e identificação de partículas individuais com dimensões de até 0,5 µm.
• Caracterização de elementos da amostra com dimensões de até 0,5 µm.
• Localização e identificação de contaminantes microscópicos.
• Mapeamento Raman (imagem) de características da amostra para mostrar a distribuição de componentes, com resolução espacial de até 0,5 µm.
   

A simples adição de um microscópio auxilia na obtenção de resolução espacial lateral (XY), mas não fornece resolução espacial de profundidade (Z). Para isso, são necessárias ópticas confocais. Existem diversos métodos em uso atualmente, alguns verdadeiramente confocais, outros pseudoconfocais, que funcionam com diferentes graus de sucesso. Para um projeto verdadeiramente confocal (que incorpora uma abertura confocal totalmente ajustável), é possível obter resolução de profundidade na ordem de micrômetros, permitindo que camadas individuais de uma amostra sejam analisadas discretamente.

Alguns microscópios Raman não possuem óptica confocal. A simples adição de um microscópio auxilia na obtenção de resolução espacial lateral (XY), mas não proporciona resolução espacial em profundidade (Z). Para isso, é necessária óptica confocal. Existem diversos métodos em uso atualmente, alguns verdadeiramente confocais, outros pseudoconfocais, que funcionam com diferentes graus de sucesso. Com um projeto verdadeiramente confocal (que incorpora uma abertura confocal totalmente ajustável), é possível obter resolução em profundidade na ordem de micrômetros, permitindo a análise discreta de camadas individuais de uma amostra.