荧光寿命技术: TCSPC, FRET, TRES和 SSTD

TCSPC 的意思是时间相关单光子计数，这种方法利 用窄脉冲光（激光或 LED）作为激发光源，检测样品发射 的单个荧光光子到达探测器的时间，多次重复该过程，最 后通过多次重复得到荧光寿命。这项技术是基于这样一个 原理：在激发脉冲光发出后 t 时间内，能够探测到的单个 荧光光子的几率正比于 t 时刻的荧光强度。

以较高重复率 (10 kHz 到 100 MHz) 出现的激光或 LED 脉冲与下一个荧 光光子达到探测器（光电倍增管 PMT）的时间是同步的。 用于计时的电子器件是时间 - 数字转换器或时间 - 幅度转 换器，一遍又一遍重复记录下这些事件，最后收集到足够 多的统计数据来重现荧光衰减过程。按照指数函数的形式 拟合荧光衰减过程获得荧光寿命参数。TCSPC 通常用来 测量从皮秒到微秒量级的荧光寿命。

在动态 TCSPC 模式下，可以进行时间短至 1 毫秒的单次测量，并且可以实现高至 10,000 次测量 的无缝采集。只要荧光寿命发生变化，那么采用 TCSPC 方法，而不是荧光强度，可以完美追踪一个动力学过程。

显然，我们需要足够数目的光子以进行数据分析，这一点 可以通过使用很高的重复率来解决，但是必须考虑到荧光 寿命及其时间范围，以保证荧光在完全衰减之前不会再次 被激发

只要能测量荧 光，就能够测量荧光共振能量转移。FRET 是对测量结果 的解释，而不是一种测量技术。出现 FRET 的条件是供体 分子的发射光谱与受体分子的吸收光谱发生重叠，二者之 间的空间距离又足够接近时，它们就发生偶极 - 偶极相互 作用，荧光能量由供体分子向受体分子转移，即以供体分 子的激发波长激发时，可观察到受体分子发射的荧光。能 量转移为 50% 时的分子间距称为福斯特距离，对于常见 的 FRET 分子对，通常福斯特距离的数值是已知的。在受 体分子在场的情况下，测量供体分子的荧光强度或荧光寿 命的变化，即可确定 FRET 效率，进而可以确定二者之间 的距离。FRET 既可以用荧光光谱（强度）测量，也可以 通过荧光寿命测量。

实验测量以下几个物理量： I_D (t_D)：没有受体分子时，供体分子在其发射峰处的 荧光强度（荧光寿命）； I_DA (t_DA)：有受体分子时，供体分子在其发射峰处的荧 光强度 ( 或荧光寿命 )； I_A (t_A)：没有供体分子时，受体分子在供体分子发射峰 处的荧光强度 ( 荧光寿命 )； I_B (t_B)：只有缓冲剂的空白溶液在供体分子发射峰处的 荧光强度 ( 荧光寿命 )。 根据实验数据，得出能量转移效率 E，再加上福斯特距离 R₀，即可计算得出供体分子和受体分子之间的距离 R。

猝灭意味着荧光辐射的减少，即非辐射衰变（Knr） 的增加。猝灭可以分为“静态”和“动态”两种形式。两种情况下荧光辐射强度都会下降，但是只有在动态猝灭时荧光寿命会发生变化。 需要注意的是：如果动态过程遵从斯特恩 - 沃尔默动力学关系式且使用的是平均荧光寿命，则应该使用平均强度进行计算，即强度平均的荧光寿命。

光漂白造成的影响主要是延长了测量时间，因为光漂白有效地减少了辐射荧光的分子的数目，其结果就跟荧光分子浓度减小了一样降低了荧光辐射强度。而荧光寿命则不受影响。

时间分辨发射光谱（TRES）是一种实验技术。在某个样品的发射光谱范围内，以一定的波长间隔测量荧光衰减。最后获得一幅强度 - 时间 - 波长 3D 图。在这幅 3D 图的三维数据集中，沿着时间坐标轴的方向观察在不同时间的光谱，而不考虑不同波长的衰减，得到的就是时间分辨发射光谱。如果样品中含有多个荧光发射体，它们发射的荧光光谱相互交叠重合，但是具有不同的荧光寿命，那么就可以利用 TRES 将这些荧光发射体的荧光光谱一条一条分离开来。

例如，二萘酚（2-naphthol）分子会发生电离而处于激发态 (Koti, 2001)，其稳态发射光谱出现两个峰，表明两种形态的二萘酚同时存在。在其发射光谱范围内以一定的波长间隔测量荧光寿命，在每个发射峰处显示出不同的衰变速率。把这些衰变的数据进行拟合，就可以看出在不同的辐射波长处各种成分的荧光寿命和 / 或荧光强度的变化情况。

非电离态的二萘酚荧光辐射峰位于354 nm，而电离态的荧光辐射峰位于414 nm，二者的寿命截然不同。在 TRES 实验中，电离态和非电离态的二萘酚的双重态模式清晰可见。非电离态的二萘酚的衰变时间为3.4 ns（357 nm），电离态的二萘酚的衰变时间为 9.4 ns（414 nm），两个时间常数代表着不同的衰变时间。下图中给出的数据是在 FluoroMax 系统中使用 DeltaHub TCSPC 电子器件以及工作频率为 1 MHz 的 NanoLED-280 脉冲激发光源测量的。

TRES 的另一个用途是测量溶剂重取向的时间常数 (Horng, 1995) 。通过观察单个的荧光团以及发射光谱随时 间的变化，可以绘出峰值能量随时间变化的关系，从而算 出时间常数。此种情况下光谱的移动起因于作为对荧光团 的激发态偶极矩的响应，溶剂分子的偶极矩重新取向。拟 合发射光谱峰值能量与时间的关系，即可获得溶剂分子的 重取向时间常数 (Horng, 1995)。

可以测量分子尺寸和分子间结合，根据样品不同，有几种方式可以做到这一点。如果荧光分子结合过程中荧光寿命发生变化，就可以采用动态 TCSPC 测量来监视其结合过程。 还可以使用时间分辨各向异性方法，因为分子结合会导致其有效尺寸变化，而分子转动相关时间是与分子有效体积成正比的，所以分子尺寸改变会带来分子转动相关时间的改变。

在下面的例子中，设置了在闪烁氙灯激发之后延迟一 段时间测量磷光光谱。如果没有时间延迟，来自样品中的 肽的短寿命的荧光以及来自样品中的铽的长寿命的磷光都 会被观察到。

通过改变延迟时间，我们可以将磷光从样品的荧光背景中分离出来，从而实现有选择地探测某些具有长寿命磷光的物种。

时间分辨磷光延迟可以用于研究镧系元素在玻璃材料中的组成。上图的例子中采用这种方法分析了在不同的玻 璃中 Er3+ 元素的分布，其寿命会随玻璃的种类以及制造工艺而不同。

取样积分器技术也叫取样积分平均，它通过在信号衰 减的全部时间内，以确定的积分窗口进行积分来测量磷光 或长寿命荧光衰减。

一般使用氙灯之类的脉冲光源，在光 源闪光后设置一个合适的延迟时间，理想情况下使其持续 到光源闪光结束之后，然后探测器开始重复测量一个积分 窗口以获得此窗口内强度的统计平均值；最后，积分窗口 渐次移动过信号衰减时间到更长的衰减时间。以这种方式， 把产生的衰减过程拟合为指数形式即可获得荧光寿命，即 衰减速率的倒数。取样积分技术过程对于长寿命的衰减过 程以及弱信号发射分子是需要一定时间的。然而，有赖于 氙灯发光脉冲的宽度，如果我们采用可调谐的光源的话， 那么荧光寿命介于 10 微秒到 1 秒范围内的信号都可以被 提取出来，并且这种方法性价比高。

SSTD 是 single shot transient digitizer 的缩写形式， 其含义是“单次击发瞬态数字转换器”。该技术使用脉冲激光或者闪烁氙灯之类的脉冲光源，每个脉冲之后信号都被捕获并实时数字化。因为每次击发后都测量一个完整的衰减过程，所以可以很容易实现快速的信号平均。 很容易通过在限定的时间范围内扫描不同波长下的地衰减信号，从而测出时间分辨光谱。这样就可以根据各自激发态的寿命来区分光谱。荧光辐射发生在皮秒至纳秒量级时间尺度内，而磷光发生在微秒至秒级别时间尺度内。通过改变信号检测门的时间位置和宽度，我们可以有选择地探测荧光或磷光光谱，下图中所示的 phenanthrene 的光谱就证明了这一点。在此实验中，使用逐渐增加的探测门时间延迟以消除荧光的贡献，成功测量了处于低温玻璃态的phenanthrene 的发射谱。

荧光辐射发生在皮秒至纳秒量级时间尺度内，而磷光发生在微秒至秒级别时间尺度内。通过改变信号检测门的时间位置和宽度，我们可以有选择地探测荧光或磷光光谱，下图中所示的 phenanthrene 的光谱就证明了这一点。在此实验中，使用逐渐增加的探测门时间延迟以消除荧光的贡献，成功测量了处于低温玻璃态的 phenanthrene 的发射谱。

应用 SSTD 技术的另一个例子是核糖核酸酶 T1 色氨酸的室温磷光 (RTP)。本例中排除掉了强度占压倒性的色 氨酸荧光，从而提取出色氨酸的磷光信号。对于使用连续性激发光源来说，这是尤其困难的。利用 SSTD 功能 还在同一仪器上测出了色氨酸弱磷光衰减 (HORIBA PTI QuantaMaster Series, 2017)。

频闪光学取样积分技术，也被称为频闪技术，是一种时域分析脉冲技术。首先是一个脉冲光源激发样品，然后在光电倍增管的倍增电极链上扫过一个很短时间的高压脉冲。随后，重复激发，使用延时脉冲发生器测量闪光之后不同时间的信号强度，构建出衰减曲线。该方法通过多次 脉冲平均来改善衰减过程的信噪比。 频闪技术是一种模拟技术，它可以直接使用脉冲频率 较低的光源（低至几 Hz），比如激光二极管、发光二极管或可调 Q 开关的 OPO 或氮气 / 染料激光器，就能够满足从大约 150 ps 直到几秒时间的寿命测试。频闪技术可以通过固定延迟门的位置和扫描发射单色仪来直接测量纳秒的时间分辨发射光谱。频闪技术的优势之一在于它可以 在线性和非线性（算术和对数形式）的时间标度内采集衰减信号。后者在解析多指数衰减过程时非常有意义，因为 在多指数衰减过程中，荧光寿命可能会有几个数量级的差别。 频闪技术的另一个优势在于它能使用低重复频率可调谐激光器，比如可调 Q 开关的 OPO 或氮气 / 染料激光器， 而 TCSPC方法则不能使用它们。频闪技术也能使用运行在 25 kHz 的激光二极管和发光二极管工作。

如图所示是采用频闪技术测量荧光寿命，测出的 ZnO 薄片的荧光寿命衰减和分布分析的例子

荧光上转换是一个双光子过程。在此过程中，样品被 两个同时产生、同时到达的近红外光子激发，然后辐射出 能量更高、波长更短的荧光光子，荧光波长位于可见光谱 区域。

虽然荧光上转换所需要的激发光功率取决于所讨论的样品，但通常都需要激光器这样的具有更高光子通量的激发源。因此，常用的标准 TCSPC 光源不具备进行上转换 测量所需要的光通量。输出波长 980 nm 的激光器可以安装在样品仓内直接激发样品来测量上转换光谱、荧光寿命甚至是量子产率。 有着高效近红外输出的 Q 开关 OPO 激光器也能够用于荧光上转换测量。

由于能量较高的紫外激发经常会导致生物 样品的光漂白甚至光损伤，所以那些在近红外波段吸收、 可以在可见波段被探测甚至成像的分子才是不无裨益的。 近红外光源因其激发能量较低而不存在这方面的问题。能实现荧光上转换的样品包括镧系元素、半导体纳米粒子和量子点。 波长同样为 980nm 的 DPSS激光器经过 TTL 脉冲调 制也可以用于 PL 上转换寿命测量，TCSPC 的 MCS 功能或者 SSTD 技术也可以应用于这里。

尽管荧光和磷光的应用非常广泛，但是应用的主要研 究领域还是两个：

• 生命科学
• 材料科学

凡是能用到稳态荧光的地方，利用荧光寿命获得信息 一定会是更为有利的方法。 下面列出的就是一些采用荧 光寿命和荧光技术的研究领域。

生命科学

Material Sciences