荧光是由光子激发分子,使其达到电子激发态后为回到基态而产生的发光。它是由单重态基态的光子吸收提升到单重态激发态而产生的。当被激发的分子返回基态时,会发射一个比被吸收光子能量更低的光子,对应于更长的波长。
荧光光谱学使用一束光来激发某些化合物分子中的电子,并使它们发光。光通过单色仪进入检测器被检测,用于测量和识别分子或分子的变化。
图. 3 雅布朗斯基图 (Jablonski, 1933), 该图阐述了在荧光现象中电子态之间跃迁的原理。左边坐标轴向上能量增加,这里给出了一个典型的荧光分子的吸收光谱。从光谱中可以看出分子吸收光子的能量或波长所在。
Fig. 4: Fluorescence lifetime decay of fluorescein (red), instrument response (blue) and fit (green). Error residuals are shown in lower graph. Here, the lifetime is approximately 4.0 ns.
简单地说,分子的荧光寿命可以被认为是它在激发态 所存在的平均时间长度。这个时间长度又依赖于分子的类型以及分子所处的局 部环境。通常情况下,激发态的时间衰减是指数形式的, 如下面的公式所示。较之荧光强度测量,使用荧光寿命具 有其优势 : 荧光寿命是一种“绝对”测量,而不是强度那样的“相对”稳态测量 ( 一个时间平均信号 )。
I(t) = I0 exp(-t/τ)
以上公式中,τ 就是荧光寿命,即荧光强度衰减为其 初始值的 1/e 的时间。
有时,由于所研究样品中包含多种 荧光分子,或者由于荧光分子处于不同的局部环境中,也 可能是分子正处于某种变化之中,都会导致出现多个激发态。此时的荧光衰减过程就更为复杂。每个激发态都会存 在一个指数形式的衰减。
此时的荧光强度可以表示为多个指数衰减函数的总和的形式(下图),式中各个指数函数前面的系数 α 就代表每一项 τ 衰减对于所观察到的总的荧光衰减所占的相对比例。
Fig. 5: Equations for obtaining fluorescence lifetimes, component time constants, amplitudes, and averages
为了方便比较每一种荧光物种的浓度,经常把系数 α 进行归一化处理;然而需要比较各自对稳态光谱(总荧光 辐射)的贡献时,则使用分数或相对大小幅度(以百分数 表示)。而有时,能够被接受的方法则是,用平均寿命来 表示一个复杂的衰减过程。然而需要注意的是,最好的方法是正确地模拟复杂的衰变,而不是仅仅试图将其拟合为单个的指数衰减形式。
大多数情况下,采用相对大小平均寿命是合适的。然而,在涉及到猝灭实验时,更好的办法是使用强度平均的荧光寿命。在一些已出版的著作里 (Lakowicz, 2006)、 (Berezin, 2010),对于这些种类的平均方法各自的优势有着比较详尽的讨论。
Fig. 6: Jablonski diagram for Phosphorescence emission
在磷光过程中,光子是从一个禁戒的三重态,而非单 重激发态,辐射出来的。荧光辐射的时间尺度通常落在皮 秒到纳秒的范围内;而磷光的持续时间则可以是微秒、毫 秒或者更长……,直至分钟或小时。 测量磷光光谱及其在这样较长时间尺度上的衰减时, 通常使用脉冲光源,例如频闪灯或者 LED。
磷光测量使用长寿命的脉冲光源,例如充氙气的闪烁 氙灯。闪烁氙灯的计时功能可以用来在不同的磷光寿命下 测量光谱,也可以获得延迟光谱。
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