稳态荧光技术

由于荧光强度取决于荧光分子的浓度，因此可以很容 易地生成标准浓度曲线，用于测定未知样品中相同分子的 浓度。

这在荧光猝灭实验中是很有用的，在猝灭实验中，添 加剂会以系统的方式降低荧光强度。

浓度曲线也可以用来研究其他分子与蛋白质之间的相 互作用，并可用于系统化跟踪蛋白质结构的变化、折叠和 去折叠、结合和解离。

作为单点荧光实验的一个例子，这是一组已知的荧光
微球的校准曲线。5 种不同已知浓度溶液被用来制作标准曲线（软件自动计算获得）。该曲线经过拟合为一个线性关系，拟合结果可用于计算未知溶液中小球的浓度。

温度不仅对荧光强度有着影响，还时常会影响到荧光 光谱的形状和波长。荧光发射组分的摩尔消光系数（或者 叫辐射速率常数）通常对温度有微弱的依赖关系。然而， 受振动耦合控制的非辐射速率常数则受到温度的强烈影 响，并随温度的升高而增加。这意味着随着温度的升高， 荧光强度将会降低。同样，碰撞猝灭也会随温度升高，也 会导致荧光强度降低。荧光还在很大程度上受荧光发射分 子周围分子的影响。在液氮或液氦冷却下测量的荧光实验 结果表明，低温下不仅荧光强度会增加，而且荧光激发和 发射光谱中的振动结构数量也会增加。在低温下，碰撞猝 灭下降，非辐射速率常数也将减小，带来荧光辐射强度的 增加。 在室温下的荧光光谱中，会出现多环芳香烃类分子 （蒽、萘、芘、苝等）的振动峰。而在 77 K 的液氮温度， 荧光峰拥有更多的精细结构，并且磷光峰变得可测量。下 图给出的就是在 298 K 室温和 77 K 的液氮温度下测得的 样品的荧光光谱。

拉曼峰经常会出现在荧光光谱中，尤其是当荧光强度 较弱时。为了去除拉曼峰，可以在相同的实验条件下测量 一个空白的溶剂的光谱，然后从荧光样品的光谱中减去这 条“空白”光谱。因为拉曼是一种与激发光的能量相关的 分子振动现象， 拉曼峰的位置在一定程度上是可以控制 的，如果一个拉曼峰干扰了样品的荧光光谱，我们可以改 变激发波长，让拉曼峰随之移动到不同的位置上去。

荧光光谱可以用于跟踪蛋白质折叠或去折叠的变化。 本例显示了浓度为 1μm 的牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）溶液中的色氨酸的荧光光谱随温度变化 的情况。温度从 5°C 逐渐增加到 70°C，荧光光谱的强度 下降，荧光峰位置向着短波长方向蓝移。各向异性或时间 分辨的各向异性荧光光谱也可以用来获得有关蛋白的尺 寸、形状和重新取向运动的信息。