Fig. 7: Top: Table of single point intensities for a calibration curve of fluorescent microspheres in different concentrations in solution measured on a FluoroMax-4 spectrofluorometer. Bottom Left: Spectra for the same microspheres. Bottom Right: Intensity vs. Concentration with a linear fit to the calibration curve.
由于荧光强度取决于荧光分子的浓度，因此可以很容 易地生成标准浓度曲线，用于测定未知样品中相同分子的 浓度。
这在荧光猝灭实验中是很有用的，在猝灭实验中，添 加剂会以系统的方式降低荧光强度。
浓度曲线也可以用来研究其他分子与蛋白质之间的相 互作用，并可用于系统化跟踪蛋白质结构的变化、折叠和 去折叠、结合和解离。
作为单点荧光实验的一个例子，这是一组已知的荧光
微球的校准曲线。5 种不同已知浓度溶液被用来制作标准曲线（软件自动计算获得）。该曲线经过拟合为一个线性关系，拟合结果可用于计算未知溶液中小球的浓度。
Fig. 8: Temperature can add thermal broadening to fluorescence spectra and increase phosphorescence quenching. Spectra of naphthalene dissolved in methanol measured at room temperature (298K) and in a liquid nitrogen dewar accessory (77K) on a HORIBA Fluorolog-3. The low temperature spectrum reveals rich vibrational structure and longer wavelength phosphorescence. Phosphorescence peaks are also shown magnified 10x for clarity. (HORIBA FluoroMax Series, n.d.)
温度不仅对荧光强度有着影响，还时常会影响到荧光 光谱的形状和波长。荧光发射组分的摩尔消光系数（或者 叫辐射速率常数）通常对温度有微弱的依赖关系。然而， 受振动耦合控制的非辐射速率常数则受到温度的强烈影 响，并随温度的升高而增加。这意味着随着温度的升高， 荧光强度将会降低。同样，碰撞猝灭也会随温度升高，也 会导致荧光强度降低。荧光还在很大程度上受荧光发射分 子周围分子的影响。在液氮或液氦冷却下测量的荧光实验 结果表明，低温下不仅荧光强度会增加，而且荧光激发和 发射光谱中的振动结构数量也会增加。在低温下，碰撞猝 灭下降，非辐射速率常数也将减小，带来荧光辐射强度的 增加。 在室温下的荧光光谱中，会出现多环芳香烃类分子 （蒽、萘、芘、苝等）的振动峰。而在 77 K 的液氮温度， 荧光峰拥有更多的精细结构，并且磷光峰变得可测量。下 图给出的就是在 298 K 室温和 77 K 的液氮温度下测得的 样品的荧光光谱。
Fig. 9: Blank-subtracted emission spectrum (red) of red microspheres at 6.7x104 beads/mL (lexc=542 nm): The non-subtracted spectrum is green. Here, two water Raman peaks for – OH bending and stretching modes (corresponding to 3380 and 1700 cm-1) can be shown in the spectrum of the blank solvent (orange) and subtracted from the sample fluorescence spectrum to better resolve the emission peak at 571 nm. All measurements were performed on a FluoroMax-4 spectrofluorometer.
拉曼峰经常会出现在荧光光谱中，尤其是当荧光强度 较弱时。为了去除拉曼峰，可以在相同的实验条件下测量 一个空白的溶剂的光谱，然后从荧光样品的光谱中减去这 条“空白”光谱。因为拉曼是一种与激发光的能量相关的 分子振动现象， 拉曼峰的位置在一定程度上是可以控制 的，如果一个拉曼峰干扰了样品的荧光光谱，我们可以改 变激发波长，让拉曼峰随之移动到不同的位置上去。
Fig. 10: Left: Spectral changes as a result of thermal unfolding of Bovine serum albumin (BSA) using a QuantaMaster fluorometer. Right: Basic structure of BSA (Bujacz, 2012)
荧光光谱可以用于跟踪蛋白质折叠或去折叠的变化。 本例显示了浓度为 1μm 的牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）溶液中的色氨酸的荧光光谱随温度变化 的情况。温度从 5°C 逐渐增加到 70°C，荧光光谱的强度 下降，荧光峰位置向着短波长方向蓝移。各向异性或时间 分辨的各向异性荧光光谱也可以用来获得有关蛋白的尺 寸、形状和重新取向运动的信息。
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