Fig. 28: A typical Excitation Emission Matrix (EEM)
三维荧光(EEM,激发发射矩阵)是一种在荧光光谱 领域应用越来越广泛的测量。EEM 是一种 3D 扫描,得到 的结果是一幅激发波长 - 发射波长 - 荧光强度的光谱图。 该方法用于各种需要进行多变量分析的应用场合,通常用 来为许多不同组分的样品提供分子指纹图谱。
最早发表的 EEM 光谱应用是在二十世纪八十年代,该技术被用于研 究人血清内低密度脂蛋白中的色氨酸荧光 (Koller, 1986) 以 及研究肿瘤患者血浆中的荧光成分 (Leiner, 1986)。
传统的扫描荧光光谱仪存在三种基本局限性,不具备 完全的 EEM 分子识别能力。首先,传统的扫描荧光光谱仪不能从根本上对荧光分子的不同浓度样本进行补偿,众所周知,由于存在内滤效应 (IFE),在样品浓度较高时,由于样品分子自身的吸收通常会超过0.1~0.2 个吸收单位,测量所得荧光光谱会失真。使用传统的荧光光谱仪器,要想对内滤效应进行校正,唯一的办法是在另一台不同的吸收光谱仪上进行第二次测量,然后根据测量结果对所测荧光信号进行相应的调整。但是这里面也存在诸多问题,因为两次测量不是同步进行的,也不是针对完全相同的体积内的样品所的。因此,传统的扫描荧光光谱仪器对样品 浓度不是真正独立的,严重制约了传统的 EEM 方法精准识别许多样品的能力。
其次,由于荧光光谱仪器主要侧重 于荧光,所以对于非荧光分子而言,就缺少了重要的吸光 度和色彩信息,而这些信息也是全面的多组分分子鉴定的 关键部分。
最后,单通道扫描设备速度很慢,需要很多分 钟甚至一小时以上的时间才能完成一整套数据的采集。因而这种扫描型的荧光仪器就受制于每天能够采集多少 EEM 数据,受限于测量那些在 EEM 采集时间内不发生变化的 样品了
EEM 荧光如果不进行内滤效应(IFE)的校正,只能 用在样品浓度较低,使得吸光度值小于 0.1-0.2 的情况下。 要发挥荧光 EEMs 的真实能力,就必须借助于多变 量分析软件,例如主成分分析法 (Principal Components Analysis, PCA)、 经 典 最 小 二 乘 法(Classical Least Squared, CLS) 以及平行因子分析法 (Parallel Factor Analysis, PARAFAC)。
Fig. 29: Blue excitation light intensity is gradually diminished due to sample absorption outside the measurement volume. Red emission light is diminished due to reabsorption of emitted fluorescent light.
荧光内滤效应,指当荧光体溶液浓度较大时,由于荧光体对激发光或发射光的吸收而导致荧光减弱的现 象。荧光内滤效应由两个过程组成:主内滤效应 (Primary Filter Effect, PIF) 和 次 内 滤 效 应(Secondary Filter Effect, SIF)。前者 (PIF) 是指激发光被样品池前端荧光物质吸收,随着光路长度增加,用于激发样品池中后部的荧光物质的入射光强度大幅减弱,导致荧光强度下降。后者 (SIF) 是指荧光辐射被部分未被激发光所激发的荧光体样品再次吸收,造成荧光强度下降。
Fig. 30: Spectral consequence of the inner filter effect. The shorter wavelength intensities of the fluorescence spectrum are diminished due to reabsorption of fluorescence. Fluorescence spectra of increasing optical density samples are without IFE correction on the left and with IFE correction on the right.
激发发射矩阵(EEMs)日益广泛地应用于水质分 析,特别是研究水中可溶解的具有生色团的有机物,即 CDOM。这些可溶解有机物包括氨基酸、腐殖酸、富里酸、天然水源中一些其它的降解物质以及水消毒杀菌处理过程中带入的一些副产品。EEMs 被用于在很低的浓度下,通常是 ppb 数量级下,确定这些物种的存在。最理想的适于此项应用的仪器就是能够同时测量荧光光谱和吸光度。由于只有在吸光度值小于0.05时,荧光才和浓度呈线性关系, 所以对于吸光度较高的样品,首先需要测量其紫外 - 可见吸收光谱,然后根据测量结果,对荧光强度进行内滤效应校正。
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