荧光光谱技术，表征G蛋白偶联受体

Brian Kobilka 和他的导师 Robert Lefkowitz 医学博士作为 2012年诺贝尔化学奖的共同获得者，于2012年12月初抵达瑞典斯德哥尔摩，准备接受颁奖。这座城市视他们为名人，甚至英雄。 

然而尽管 Kobilka 获得了诸多赞誉，他仍然保持着中西部人的谦逊："获奖有很多运气，因为有太多的优秀科学家，为科学的进步做出了诸多贡献。我的贡献是确定 GPCRs 在非活性和活性状态下的三维结构，并确定 GPCR 与G蛋白复合的结构。" 

Kobilka 和 Lefkowitz 拥有一个大型合作团队，主要描述G蛋白偶联受体（GPCRs）的结构和工作原理。它们是人类蛋白质大家族的一部分，是现在几乎一半药品的靶标。

我们的机体功能实现需要身体不同部位之间的大量交流。这种交流是通过神经进行的，神经末端会释放一种叫做神经递质的小分子。比如我们的大脑会通过自主神经系统这样一个特殊网络来调节心血管功能。从心脏神经末梢释放的神经递质，通过激活特殊的 GPCRs 将信息传递给心肌细胞，进而使心跳加速或减慢。 

同样，当一种激素被释放到血液中时，它分布在整个身体中，它也会寻找对该激素敏感的受体，进而发出指令。“例如，如果你服用了太多的胰岛素，你的血糖就会下降。”Kobilka 举例说。"这时胰腺分泌一种叫做胰高血糖素的激素，胰高血糖素被肝细胞表面特定的 GPCR 识别，肝脏就开始释放葡萄糖，帮助血糖恢复。而 GPCRs 能够将激素和神经递质的信息从细胞外部传递到细胞内部，通常是通过G蛋白的蛋白质实现的。"

总结来说，受体接收来自神经递质或者是激素的信息后，结构会发生变化并激活G蛋白，从而改变了细胞的行为。

Kobilka 的主要研究便是确定 GRCRs 的结构，并且基于这些结果使用计算方法为现在已确认结构的 GRCRs 筛选药物了。

他兴奋的分享到："我们开发了获取 GPCR 晶体结构的蛋白质工程策略。因此在我们最初的GPCR 晶体结构之后，其他人也已经能够将非活性和活性状态下的 GPCR 结晶化。现在这些结构中有许多都是可以获得的，基于计算机的药物筛选对这个受体家族来说也是非常可行的方法。"

研究人员已经确定了近 800 种不同的 GPCRs，是人类蛋白质的最大家族之一。这些蛋白质几乎调节着每一个身体过程，包括我们大脑的运作和心脏的跳动。针对这些受体的药物包括很多人们熟悉的药物，如医生用来治疗精神分裂症的再普乐；抗组胺药氯雷他定；以及用于治疗胃溃疡和胃食管反流病的善胃得。

GPCRs 也参与了某些类型的药物成瘾，如对吗啡和其他阿片药物的成瘾。事实上，Kobilka 是2016年一项研究的合著者，该研究使用基于结构的方法来确定一种新的阿片类药物。在动物研究中，这种药物有抑制疼痛的特性，而且没有潜在的致命性呼吸抑制。

像大多数研究人员一样，Kobilka 并没有经历过具有里程碑意义的突破时刻，他的研究是一个缓慢并且不断突破的过程。

Kobilka 最早在耶鲁大学医学院攻读医学学位。根据公共卫生服务计划，他在毕业并经过住院医师培训后需在医疗服务不足的社区工作三年。Kobilka 选择了在圣路易斯的内科当住院医生。这时他开始对病人病情不稳定的重症监护医学感兴趣。病人需要紧急干预，通常使用作用于G蛋白偶联受体的药物，包括使用肾上腺素能（神经细胞）和毒蕈碱受体来调节他们的心率和血压，以及使用阿片类受体来控制疼痛。

再后来他获得了杜克大学的心脏病学奖学金，并顺利进入了罗伯特·莱夫科维茨(Robert Lefkowitz )的实验室，当时莱夫科维茨实验室因其对肾上腺素能受体的开创性研究而闻名。

Kobilka 回忆:“一加入莱夫科维茨实验室，我就成了一群非常有才华的年轻科学家中最缺乏经验的人，他们主要是博士后和少数研究生。我对使用的任何技术都不熟悉，也不熟悉当时在莱夫科维茨实验室进行研究的相关文献。我的同事们都很友好，但也都在忙自己的项目，我真的不知道从哪里开始。”

于是他在费城北部的默克实验室向 Richard Dixon 学习分子生物学，并学会了如何制备和筛选cDNA 文库。回到杜克大学后，Kobilka 在莱夫科维茨实验室里建立了一个分子生物学实验室。

最初的目标是筛选由 Richard Dixon 准备的文库。许多最初的结果被证明是与各种探针的非特异性结合，这使得他们的研究时常伴随着兴奋和沮丧。在经历了大约一年的失败后，他们的团队开始相信 β2ARs  ( β2 肾上腺素能受体)在大多数细胞中的水平很低低，以至于研究人员可能无法从cDNA(由单链RNA合成的互补DNA)文库中分离出克隆。

最终，默克公司和杜克大学的研究小组分离出一个包含完整编码序列但不含内含子的基因组克隆。内含子是一种 DNA 或 RNA 分子，它不编码蛋白质，也不中断基因序列。 这导致了其他几个肾上腺素受体基因以及孤儿受体的成功克隆。这种受体被证明是血清素(神经递质)受体家族的一员。最初的克隆体都有7个跨膜结构，就像视紫红质，一个专门用于检测光的G蛋白偶联受体。

然而，这些研究并没有揭示受体在分子水平上是如何工作的。Kobilka 开始考虑获得受体的晶体结构。

与此同时，Richard Tsien（教授，博士）刚刚从耶鲁大学搬到斯坦福大学。他当时正在帕洛阿尔托建立一个新的分子和细胞生理学系。于是 Kobilka 就在 Tsien 新建的院系里找到了一个职位，并专注于两个问题：确定特定肾上腺素能受体亚型的生理作用及了解β2AR的结构和激活机制。

Kobilka 使用基因敲除的小鼠来实现第一个目标。基因敲除小鼠是一种实验室小鼠，研究人员通过替换或用人工的DNA片段破坏现有的基因而使其失活，或 "敲除"。Kobilka 与他的同事 Greg Barsh 一起为9个肾上腺素能受体基因中的5个创建了基因敲除小鼠品系，从而能够确定肾上腺素能受体在心血管功能和行为中的作用。

为了实现第二个目标，Kobilka 必须制造大量的受体蛋白， "到1993年，我们能够在昆虫细胞中表达和纯化足够数量的功能性 β2AR，开始使用最敏感的生物物理技术之一的荧光光谱来研究受体结构。我们环境敏感的荧光探针标记了纯化的β2肾上腺素能受体（β2AR），通常将它们与引入特定区域的单一活性半胱氨酸连接。”

"使用这种方法，我们能够实时观察配体引起的构象变化。这些相对简单的荧光实验提供了对β2AR 动态特性的重要证据，这将最终指导我们对 β2AR 和 β2AR-Gs 复合物的结晶策略。"

蛋白质的晶体结构为激素和神经递质的结合提供了一个模型或模板。计算机可以存储一个虚拟的化合物库。研究人员可以检测许多药物和分子，看看它们是否结合了，然后计算机可以根据结合情况进行排序。

通过不断增多的成果，Kobilka 的团队能够制备足够的 β2AR 来开始晶体学试验。2004年，在多次失败后，该团队获得了第一个 β2AR 晶体，并随后获得了 β2AR-Fab 复合物的 3.4Å（ångström，每个相当于0.1纳米一个单位）。Kobilka 说："这是我们第一次看到β2AR的三维结构，但更高分辨率的结构将很快出现。

这些最初的 β2AR 结构代表了非活性状态。然而 Kobilka 团队的目标是了解激动剂的结合如何导致G蛋白的激活。通过与斯克里普斯公司的密集合作，Kobilka 团队使用各种方法研究β2AR对G蛋白Gs的激活，并积累了稳定和结晶化β2AR-Gs复合物的试剂和专业知识。

Kobilka 和他的团队在2011年发表了β2AR-Gs的晶体结构，并进行了两项配套研究，以确定该分子的动力学特征。Kobilka 说："这些综合研究在分子水平上为GPCR信号传递提供了前所未有的基础。"

Kobilka 的团队尝试了各种实验来了解受体如何与G蛋白结合的。他们使用了稳态荧光光谱，这让他们学会了如何尝试稳定一个受体以进行结构研究。

Kobilka 使用 Fluorolog3/TCSPC（时间相关单光子计数）荧光光谱仪。这种模块化的仪器可以观察到分子、化学和电子特性，达到纳米级。

"从我在斯坦福大学工作的第一天，我就想了解 GPCRs 在三维空间的样子。我们花了很长时间才能够生产出足够的蛋白质来开始结晶学研究。但在早期，我们生产的蛋白质足够来研究蛋白质结构的低分辨率解析。荧光光谱技术是理想的，因为你不需要太多的蛋白质。如果你能用一个小的荧光团标记蛋白质，你就能了解它在不同条件下的构象变化。”

Kobilka团队将荧光探针标记在横跨整个细胞膜的跨膜段的末端。他们可以看到从拮抗剂到激动剂的巨大结构变化，然后甚至从激动剂到激动剂加 G蛋白的进一步变化。

"通过这些信息，这项研究让我们了解到这些蛋白质比我们想象的更加活跃。"

Kobilka 的办公室没有任何关于诺贝尔成就的纪念品或展品。

在紧凑的办公室里，墙壁上有一张他孙子的照片和一个镶框的艺术品。一块大白板占了一面墙的大部分，部分覆盖着彩色标记的方程式和图表。但占据白板大部分的是他的孙女们用绿色记号笔画的图画，也许是在掩盖这位科学家的下一个突破口。Kobilka不以为然——这是个低调的家伙。

Kobilka 认为基础研究需要有耐心，因为它是密集且发展缓慢。

“就研究而言，如果你正在做一些真正具有挑战性的事情，那么你不能期望立即得到满足，但你所做的每一个小的增量进展，如一个实验，可能只是一个大故事的一部分。这个实验可以在短期内发生，你可以看到有趣的事情发生。而这将给你一个重要的信息，让你继续前进。因此，在一个漫长的项目中，有一些小的进展可能是令人兴奋的。"

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