鉄は摂りすぎないほうがいい？！ 鉄イオンの動きから疾患の原因を探る~ヘム選択的蛍光プローブの開発~

岐阜薬科大学 薬化学研究室 　平山 祐（ひらやま たすく）准教授

鉄は人間が生きていくうえで不可欠なミネラルです。しかしながら、過剰摂取によりタンパク質に結びついていない鉄イオンが増えると、細胞に障害を与えてさまざまな疾患の原因にもなることがわかってきました。鉄イオンの蛍光プローブ開発に取り組まれるなか、これまで世の中に無かった“ヘム”^※1の蛍光プローブ開発に成功された 岐阜薬科大学 薬化学研究室　平山 祐 准教授にお話を伺いました

私の蛍光プローブの研究は、鉄イオンの蛍光プローブの開発からはじまりました。数年この鉄イオンの挙動や病気との関連を調べていましたが、鉄イオンの研究を進めるとヘムの挙動についても調べる必要がでてきました。体内で鉄イオンは主にヘムという形でヘモグロビンをはじめ、いろいろなタンパク質のなかに含まれています。ヘムはポルフィリン環^※2という、ピロール^※3が４つ組み合わさった特殊な分子の真ん中に鉄がはまった構造をしています。

ヘムと鉄イオンは機能としてみると別のものですが、リンクしているところもあって、鉄イオンだけ見ていても、ヘムだけ見ていても不十分で、生体のなかでの鉄の挙動を理解するためには双方を相互的に調べていく必要があります。研究を始めた当時、ヘムの動きを捉えられる蛍光プローブが存在しなかったことから、ヘムの蛍光プローブ開発に取り組みました。ヘムは人間だけでなく他の動物、植物、菌類に至る色々な生命体が利用しているため、ヘムの蛍光プローブは幅広い領域での貢献が期待できます。

蛍光プローブとは、自分の見たい物質が有るか無いかで光るようになったり、光らなくなったり、また色が変わったりする蛍光化合物のことです。蛍光プローブが一躍有名になったのは細胞内のカルシウムの動きを観察するために使用される蛍光プローブで、その後も次々とさまざまな蛍光プローブが開発され、今ではがん細胞の存在箇所を確認するためにも使用されています。色素を使ったプローブだと、大きさは分子量が300から800の間くらいの大きさで、ペプチドにリンクさせるものは分子量が1000を超えるものもあります。
良い蛍光プローブは単に光ったり、光らなかったりするだけでなく、細胞に入れることでその細胞が弱ったり、死んだりしないものが求められています。つまり極力細胞に影響を与えない、毒性が無く化学反応が起こらないものを選ぶ必要があります。

また最近では蛍光プローブを処理したあとの影響も重視されてきています。例えば、カルシウムの蛍光プローブのように蛍光プローブ自体が金属をキレート^※4するタイプの場合、あるところから金属を引き抜くような効果（スカベンジャー^※5効果）が起こる可能性があります。その場合、もともと細胞のなかに存在する金属をとってしまい、そのあとに起こっていたであろうイベントを阻害していることになってしまいます。このような現象が起こらない蛍光プローブの開発が現在求められています。

ヘムの蛍光プローブ（ヘムと蛍光プローブが化学反応して光を発する物質）を開発する上で重要なポイントがありました。ヘムは細胞のなかではタンパク質の奥底に格納されていることが多いのですが、私が観察したいヘムはそのタンパク質から外れたもので、このヘムが色々な細胞のシグナルにどのような影響を与えているかを観察することが目的でした。ただその濃度がとても低く、鉄イオンに比べると100分の１ほどしかないので、感度の良い（反応速度の速い）蛍光プローブが必要でした。

試行錯誤の末に作り出したヘムの蛍光プローブは反応がとても速く、反応速度解析をするのに苦労していました。鉄イオンの蛍光プローブは光の強度が一定に達するまで30分程度のスピードでしたが、ヘムの蛍光プローブでは数十秒で蛍光強度が一定になってしまうほど反応が速く、秒単位での蛍光スペクトル変化を観察できませんでした。また私の研究室で使っている色素だと、裾を含めた蛍光スペクトル全体を取得するためには300nm程度の波長範囲のスペクトルを取得する必要があります。この波長範囲を一般の蛍光分光装置で測定すると20-30秒かかってしまい、ヘムと蛍光プローブの反応を観察することができません。

そこで何かいい手法はないかと、蛍光スペクトル装置をウェブサイトで検索していた時、たまたまHORIBAの蛍光吸光分光装置 Duetta（以下、Duetta） を見つけました。製品のアプリケーション動画のなかで、すごい速さでスペクトルが出てくる場面を見て、求めているデータが得られるのではないかと思い、試してみたいと思いました。また製品資料にも秒単位の測定ができるという記載があったので、私のほうからHORIBAさんに問い合わせをしました。最初にDuettaで測るまでは本当に測れるか半信半疑でしたが、見たかったスペクトルがDuettaでは数秒の精度できっちりとれたのです。数秒間隔で蛍光スペクトルがとれたことは研究のターニングポイントとなりました。単一波長の発光強度を数秒間隔で観察することは従来の装置でもできるのですが、スペクトルの変化をみることでバックグラウンドの影響などではなく蛍光分子に由来する蛍光強度の変化だけを追えていると判断でき、正確な評価をすることができました。

蛍光吸光分光装置 Duetta 製品サイトへのリンク