A-TEEM 蛍光指紋測定


一般に、蛍光は、吸光度、FTIR、ラマンなどの他の分光技術と比較して非常に感度の高い技術ですが、蛍光指紋測定と呼ばれる励起蛍光マトリクス(Excitation Emission Matrix; EEM)測定による3次元データを用いることで、より複雑な成分の分析精度が向上します。 そして、EEM測定を進化させたHORIBA独自の蛍光指紋測定は、特定のサンプルの吸光度、透過率、およびEEMを同時に取得する吸光-透過励起蛍光マトリクス(Absorption-Transmission Excitation Emission Matrix; A-TEEM™)測定です。 HORIBAは、水中有機物分析用に開発された蛍光評価装置Aqualogでこの技術を採用しました。 A-TEEM分光法は、水・ワイン・医薬品などの成分分析に最適な新しい分光技術です。 これはシンプルで高速な「カラムフリー」技術であり、クロマトグラフィー、質量分析、IRといったQC/QAで用いられる従来の分析技術とは異なるユニークな特徴があります。 この手法は、芳香族分子などの蛍光成分を含む溶液中の試料に最適ですが、吸光度測定により蛍光成分を含まない試料も分析可能です。 また、A-TEEM分光法は、通常の蛍光測定では希釈が必要なサンプルに対しても、吸光度測定により蛍光強度が自動的に補正されるため、ラボ用途だけでなく、生産プロセスやQC/QAプロセスにおいても使用できます。
このようにA-TEEM分光法を用いれば、従来の蛍光光度計よりもはるかに正確な蛍光指紋の取得が可能となり、現在HPLCや質量分析計などの従来の分析機器を、よりシンプルで高速かつ安価な分析ツールに置き換えることができることが実証されています。 また多成分分析においては、多くの試料測定から得られたA-TEEMデータに対して主成分分析(PCA)、古典的最小二乗法(CLS)、並列因子分析(PARAFAC)などの多変量分析法(ケモメトリックス)を適用してモデルを作成し、試料の各成分の割合、さらにはその割合から濃度を計算することができます。





A-TEEMの独自性とメリット


蛍光分光光度計において3D蛍光や蛍光指紋とも呼ばれる励起発光マトリクス(EEM)は、さまざまな励起波長で発光スペクトルを順次スキャンし、その結果を三次元で再構成することによって取得できます。 これは、FTIR、HPLC、MSなどの他の分析手法と同様に、多変量解析ソフトウェアで成分分析が可能です。 実際に、食品・水質・製薬など多くの分野で、EEMによる成分分析の科学論文が発表されています。 ただし従来の蛍光分光光度計を使用する場合、2つの課題があります。 1つ目は、EEMを収集するのに非常に長い時間が必要なことです。 信号の明るさ、および必要な波長範囲と解像度によりますが、数十分程度かかります。 もう1つの課題は、蛍光指紋自体の形状が試料濃度によって変化する可能性があることです。 同じ分子を異なる濃度で測定する場合、正しいEEM測定ができず成分分析が困難になります。 正しい分析をするには、スペクトルの形状が濃度によらず常に真の形状を得る必要があります。 従来の蛍光分光光度計のこれら2つの課題を解決することが、A-TEEM技術の開発のモチベーションとなりました。
HORIBAのユニークなA-TEEM技術によって、これら2つの課題を克服することができます。 まずCCD検出器を採用することで数秒から数分でEEMを取得することを可能にしました。 また、吸光度を蛍光と同時に収集することで、その吸光度を使用して吸光度による影響(内部遮断効果)を補正し、濃度によらず真のスペクトル形状、すなわち真のEEM蛍光指紋を簡便に取得することができます。 この技術をA-TEEM™と呼んでいます。 内部遮断効果を補正することにより、従来の蛍光分光光度計よりもはるかに精度の高い成分分析が可能になりました。 以下は、小さな濃度差でもEEMの形状に大きな影響を与えることを示す例ですが、適切な内部遮断効果の補正を行うと濃度によらず同じEEMを取得できることがわかります。
斜めから見たEEMの三次元等高線。励起波長、発光波長、発光強度の3つの軸で構成。
1秒で取得したフルオレセインのEEMの等高線
また、同じ試料の吸光度を蛍光と同時に収集することで、その吸光度を使用して内部遮断効果を補正することで、濃度によらず真のスペクトル形状、すなわち真のEEM蛍光指紋が簡便に取得できます。 HORIBAはこの技術をA-TEEM™と呼んでいます。内部遮断効果を補正することにより得られるA-TEEM蛍光指紋は、ケモメトリクスによるデータ分析において、蛍光光度計からの単純なEEMで達成できるよりもはるかに精度の高い成分分析を提供します。 以下は、単一の分子内の小さな濃度差でもEEM蛍光指紋の形状に大きな影響を与えることを示す例ですが、適切な内部遮断補正を行うと、A-TEEM蛍光指紋は濃度によらず同じイメージです。

蛍光・吸光同時測定による自動吸光度補正


内部遮蔽効果 (IFE: Inner Filter Effect)とは、励起光の吸収と蛍光の再吸収による影響により、蛍光スペクトル形状が真の状態から歪むことを言います。
蛍光・吸光同時測定による自動吸光度補正
一次内部フィルター効果:サンプルにより励起光が吸収される効果
二次内部フィルター効果:サンプルにより蛍光発光が吸収される効果

吸光度で蛍光スペクトルを補正し、本来の発光スペクトルを取得できます。

内部フィルター効果の補正を適用した場合と適用しない場合の、2種類の濃度の硫酸キニーネを溶かした0.1 M過塩素酸(水溶液)で希釈したトニックウォーターののEEM。